Welche Rolle spielt Spermien-DNA-Fragmentierung bei Kinderwunsch?

Ein unerfüllter Kinderwunsch betrifft 15–20% der Paare weltweit.¹ Die Ursachen der Unfruchtbarkeit sind gleichmäßig auf beide Geschlechter verteilt.² In den vergangenen Jahren hat das Interesse an der Testung der Spermien-DNA-Fragmentierung (SDF) für die Beurteilung und Therapie der männlichen Infertilität deutlich zugenommen. Was man zum aktuellen Stand wissen sollte.

Unter Spermien-DNA-Fragmentierung (SDF) versteht man strukturelle Schäden bzw. Brüche in der DNA reifer Spermatozoen, die eine molekulare Anomalie der Spermien darstellen und das Fertilitätspotenzial beeinträchtigen können.^3,4 Die Bestimmung der SDF könnte daher eine wertvolle Ergänzung in der diagnostischen Abklärung männlicher Unfruchtbarkeit sein; die SDF wird gegenwärtig als einer der vielversprechendsten Biomarker in der experimentellen und klinischen Andrologie diskutiert.

Hintergrund

Schäden an der Spermien-DNA werden als molekulare, strukturelle Veränderungen bzw. Strangbrüche der normalen DNA-Struktur definiert, die sowohl einzelne als auch beide DNA-Stränge betreffen können. SDF kann durch verschiedene Prozesse ausgelöst werden. Dazu zählen fehlerhafte Verpackung der DNA während der Spermatogenese, zelluläre Apoptose sowie oxidativer Stress. Diese Prozesse können mit verschiedenen pathologischen und umweltbedingten Faktoren in Zusammenhang stehen.^5–7 Obwohl die Befruchtungsfähigkeit von Spermien mit SDF nicht zwingend beeinträchtigt ist, zeigen mehrere in den letzten Jahren veröffentlichte Metaanalysen, dass eine erhöhte SDF die Embryonalentwicklung und die Einnistung negativ beeinflussen kann und Schwangerschaften mit erhöhten Fehlgeburtenraten sowohl bei natürlicher als auch bei assistierter Reproduktion zur Folge haben kann.^8–11

Darüber hinaus ist bekannt, dass SDF bei Männern mit pathologischen Ejakulatparametern gehäuft auftreten. Es wird angenommen, dass SDF auch in Fällen von Unfruchtbarkeit bei Männern mit normalem Spermiogramm oder sogenannter idiopathischer männlicher Unfruchtbarkeit (IMI) und „unexplained male infertility“ (UMI) eine Rolle spielt. Die American Society of Urology hält gemeinsam mit der American Society for Reproductive Medicine (ASRM) fest, dass die Evidenzlage eine routinemäßige SDF-Testung in der klinischen Praxis bislang nicht hinreichend unterstützt; diese Einschätzung erfolgte jedoch vor der Publikation jüngerer Metaanalysen.¹²

Die European Association of Urology (EAU) hat hingegen einen konsultativen Rahmen für die Anwendung der SDF-Diagnostik sowie die testikuläre Spermiengewinnung formuliert, betont dabei jedoch ausdrücklich eine indikationsgerechte Nutzung und nicht deren routinemäßige Anwendung.¹³

Das Laborhandbuch der Weltgesundheitsorganisation (WHO) aus dem Jahr 2021 hat SDF in die erweiterte Spermaanalyse zur Untersuchung und Aufbereitung menschlichen Ejakulats aufgenommen. Es werden vier Testverfahren zur Messung der SDF beschrieben.¹⁴

SDF-Testverfahren

Die zur Bestimmung der SDF eingesetzten Testverfahren unterscheiden sich sowohl hinsichtlich ihrer methodischen Ansätze als auch in Bezug auf die jeweils efassten Formen von DNA-Schäden erheblich.

Der TUNEL-Assay („terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling“) sowie der Comet-Assay (Einzelzellgelelektrophorese) detektieren unmittelbar das Vorhandensein von Einzel- und/oder Doppelstrangbrüchen der DNA.

Während sich der TUNEL-Assay durch die Markierung freier 3’-OH-Enden direkt für den Nachweis von Einzel- und Doppelstrangbrüchen der DNA eignet, basieren die Methode der Acridinorange-Durchflusszytometrie (AO-FCM) sowie der Spermien-Chromatin-Dispersions-Test (SCD) auf der Erfassung der strukturellen Integrität und Denaturierbarkeit des Spermienchromatins und zeigen damit eher indirekte Marker der SDF.

Bei der AO-FCM wird der Anteil nativ doppelsträngiger DNA im Vergleich zu denaturierter einzelsträngiger DNA durch Acridinorangefärbung quantitativ bestimmt und ein daraus abgeleiteter DNA-Fragmentierungsindex als Maß für die Destabilisierung des Chromatins angegeben. Der SCD-Test ermittelt die Halobildung von DNA-Schleifen nach kontrollierter Denaturierung und Proteinentfernung: Ausgeprägte Halos ergeben sich aus der Nukleoproteinstruktur von DNA mit intakter DNA, stark fragmentierte DNA zeigt nur kleine Halos oder gar keine.

Im Vergleich zum TUNEL-Assay gelten AO-FCM und SCD als methodisch weniger spezifisch für definierte Strangbrüche, erlauben jedoch eine pragmatischere Beurteilung der Chromatinvulnerabilität und damit der SDF, teils mit höherem Durchsatz. Die bestimmten Cut-off-Werte dieser Methoden sind spezifisch für jedes Verfahren und die jeweilige Durchführung. Für den klinischen Einsatz ist es daher erforderlich, dass die entsprechenden Grenzwerte durch das ausführende Labor festgelegt und validiert werden. Außerdem gilt es zu unterstreichen, dass die Studienlage noch keinen jeweiligen definitiven Grenzwert zulässt, die Studien diesbezüglich nicht harmonisiert sind und daher in den Leitlinien auch noch keine definitiven Grenzwerte einheitlich akzeptiert sind. Damit ein Test für den individuellen Patientenkontext von Nutzen ist, genügt es nicht, populationsbezogene Korrelationen zu betrachten. Vielmehr müssen Daten zu positiven und negativen Vorhersagewerten vorliegen, um den tatsächlichen klinischen Nutzen bewerten zu können.

TUNEL-Assay

Der TUNEL-Test prüft spezifisch DNA der Einzel- oder Doppelstrangbrüche der Spermien. Hierfür werden die freien 3’-OH-Enden an den DNA-Strängen als Target-Marker verwendet. In einem ersten denaturierenden Schritt wird zunächst die Spermienmembran durchlässig gemacht, sodass spezifische Enzyme und Nukleotide in den Zellkern eingebracht werden können. Anschließend kommt die terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) zum Einsatz: Sie fügt nun markierte Nukleotide – beispielsweise fluoreszierende oder mit Biotin versehene – genau an diese freien Enden an. Je mehr dieser 3’-OH-Enden frei exponiert sind, desto stärker ist die DNA fragmentiert. Das bedeutet: Je stärker eine DNA-Struktur geschädigt vorliegt, umso mehr assoziieren sich markierte Nukleotide an. Diese werden sodann anschließend entweder unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht oder, bei der durchflusszytometrischen Methode, mit einem Durchflusszytometer automatisiert und in „high volume“ ausgewertet. Die Intensität des Fluoreszenzsignals in jeder einzelnen Zelle oder der prozentuale Anteil der markierten Spermien an der Gesamtprobe geben Auskunft darüber, wie stark die DNA beschädigt ist.

Der TUNEL-Test liefert somit einen direkten und hochspezifischen Nachweis für DNA-Strangbrüche. In der Praxis gilt er als Referenzmethode, wenn das Ausmaß der SDF beurteilt werden soll.¹⁵

Comet-Assay

Im Comet-Assay werden Spermien zunächst in eine dünne Schicht aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet, die auf einem Objektträger aufgebracht ist. Nach dem Erstarren der Agarose folgt eine Lysephase, in der die Spermienmembranen und der größte Teil der Proteine durch detergens- und salzhaltige Puffer entfernt werden, sodass im Wesentlichen nur der nukleäre DNA-Gehalt in verstreut, aber noch lokalisiert vorliegender Form übrig bleibt. Der Objektträger wird in alkalischen Puffer gebracht, wobei es zu einer Denaturierung der DNA mit Offenlegung vorhandener Einzel- und Doppelstrangbrüche sowie alkalilabiler Stellen kommt. Unter diesen alkalischen Bedingungen wird eine Elektrophorese durchgeführt: Die negativ geladene DNA wandert im elektrischen Feld aus dem ursprünglichen Kernbereich (dem „Kopf“ des Kometen) in Richtung Anode. Intakte, hochmolekulare DNA bleibt weitgehend im Kopf, während fragmentierte Teile der DNA mit geringerem Molekulargewicht weiter in das Agarose-Gel hineinwandern und den charakteristischen „Kometenschweif“ bilden. Nach Beendigung der Elektrophorese werden die DNA-Strukturen durch Färbung mit einem fluoreszierenden Farbstoff (z.B. Ethidiumbromid oder SYBR Green) sichtbar gemacht und durch Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet.

Die Einschätzung des Grades der SDF erfolgt sowohl qualitativ als auch quantitativ. Neben einer semiquantitativen Auswertung des morphologischen Bildes des Kometen (z.B. Einteilung in Schadensklassen) verwenden wir computergestützte Bildanalysesysteme zur Erfassung von Parametern wie Schweiflänge, prozentualem Anteil der DNA im Schweif („% tail DNA“) und „tail moment“ (Produkt aus Schweiflänge und „% tail DNA“), die direkt mit dem Ausmaß der DNA-Schädigung in der einzelnen Spermienzelle korrelieren.

Aufgrund seiner hohen Sensitivität für verschiedene Arten von DNA-Schädigung (Einzelstrangbrüche, Doppelstrangbrüche, alkalilabile Stellen) und seiner Einzelzellauflösung ist der Comet-Assay ein geeignetes Verfahren zur detaillierten Charakterisierung der SDF, er ist allerdings sehr aufwendig und von strenger Standardisierung der Protokolle und Auswertung abhängig.¹⁶

Acridinorange-Durchflusszytometrie (AO-FCM)

Bei der AO-FCM macht man sich zunutze, dass Acridinorange je nach Zustand der DNA unterschiedlich leuchtet. Das Prinzip ist simpel: Acridinorange lagert sich in doppelsträngige DNA ein und leuchtet dann grün. Trifft es auf einzelsträngige oder beschädigte bzw. denaturierte DNA, verschiebt sich das Licht ins Rote. Um gezielt herauszufinden, wie anfällig die Spermien-DNA für Denaturierung ist, behandelt man die Spermien zuerst mit einem detergenshaltigen Puffer bei niedrigem pH. Dadurch entpackt und öffnet sich bei vorgeschädigtem oder instabilem Chromatin die DNA teilweise, während intakte, eng gepackte DNA stabil bleibt und ihren Doppelstrang behält. Danach färbt man die Spermien mit Acridinorange und analysiert sie mittels Durchflusszytometer. Im Durchflusszytometer wird für jede einzelne Spermienzelle gemessen, wie stark sie grün oder rot fluoresziert. Die Werte werden in einen zweidimensionalen Dotplot eingetragen. Am Ende wird aus dem Verhältnis von rotem Licht zur Gesamtsignalintensität (oder von Rot zu Grün) der sogenannte DNA-Fragmentierungsindex (DFI) errechnet. Ein erhöhter DFI reflektiert eine erhöhte Chromatinvulnerabilität und wird in der Regel mit einer verminderten Fertilität sowie ungünstigen Reproduktions-Outcomes assoziiert.

„Spermien-Chromatin-Dispersions“(SCD)-Test

Beim SCD werden Spermien zuerst in Agarose eingebettet und auf einem Objektträger fixiert. Danach werden die Proben nacheinander mit einer milden Säure und einem lysierenden Puffer behandelt. Diese Schritte entfernen die Plasmamembran und fast alle kernständigen Proteine, vor allem die Protamine. Nach dieser Dekondensation kann sich das Spermienchromatin – je nach struktureller Integrität – radial um den verbliebenen Kernrest ausbreiten. Unter dem Fluoreszenz- oder Phasenkontrastmikroskop sieht man, dass Spermien mit weitgehend intakter, kaum fragmentierter DNA einen deutlich erkennbaren Halo aus DNA-Schleifen um einen dichten Kern („core“) zeigen. Spermien mit stark fragmentierter DNA bilden dagegen kaum einen Halo oder gar keinen, weil ihre zerstückelten DNA-Stränge keine stabile Schleifenstruktur mehr halten können. Dadurch bleibt ihre Dispersionsfähigkeit begrenzt. Für die Auswertung klassifiziert man eine repräsentative Zahl von Spermien in verschiedene Halokategorien – groß, mittel, klein oder kein Halo – und berechnet daraus den prozentualen Anteil der Zellen mit eingeschränkter Halobildung. Dieser Wert spiegelt das Ausmaß der DNA-Fragmentierung wider.

Am Ende liefert der SCD-Test so einen indirekten, aber praxisnahen und leicht anwendbaren Parameter zur Beurteilung der SDF und damit der Chromatinintegrität.¹⁷

Wann testen?

Trotz einer zunehmend umfangreichen Evidenz zur SDF existiert bislang keine weltweit einheitliche Leitlinie, die den routinemäßigen Einsatz von SDF-Tests in der Abklärung männlicher Infertilität empfiehlt. Aus klinischer Sicht ist die SDF-Testung insbesondere bei Patienten mit unerklärter oder idiopathischer Infertilität, wiederholten Fehlgeburten, bei Vorhandensein einer klinischen Varikozele sowie bei Vorliegen von Lebensstil- oder Umweltrisikofaktoren von Nutzen. Zu Letzteren zählen höheres Alter, Rauchen, Drogen- oder Alkoholabusus, unausgewogene Ernährung, Adipositas oder Diabetes ebenso wie chronische Exposition gegenüber ionisierender Strahlung, Umwelttoxinen oder Hitzestress. Weitere Indikationen sind Kryptorchismus, systemische Entzündungen, aber auch insbesondere urogenitale Infektionen und Malignome. Zudem wird die SDF-Testung sowohl vor einer assistierten Reproduktionstherapie (ART) als auch danach bei Misserfolg empfohlen und kann bei Männern erwogen werden, die ihre Spermien kryokonservieren lassen möchten.

Angesichts des zunehmenden Interesses an der SDF-Diagnostik besteht ein klarer Bedarf, die klinischen Szenarien zu definieren, in denen die Kenntnis des SDF-Status des männlichen Partners das therapeutische Vorgehen bei unfruchtbaren Paaren wesentlich beeinflussen kann. Eine präzise Festlegung geeigneter Indikationen ermöglicht es, den diagnostischen und prognostischen Nutzen der SDF-Testung für möglichst viele Paare zu realisieren und gleichzeitig ihren unsystematischen beziehungsweise wahllosen Einsatz bei allen unfruchtbaren Männern zu vermeiden.¹⁸

Die aktuellen Leitlinien der European Association of Urology (EAU) führen SDF zwar als evidenzbasierten Bestandteil der erweiterten Samenanalyse, betonen jedoch, dass der Einsatz auf ausgewählte klinische Konstellationen beschränkt bleiben sollte.¹⁹

Management von unfruchtbaren Männern mit erhöhter SDF

Im Allgemeinen ist bei unfruchtbaren Männern mit erhöhter SDF kein wiederholter oder bestätigender Test erforderlich. Stattdessen sollten die zugrunde liegenden Ursachen und Risikofaktoren gezielt behandelt werden. Hierzu zählen die operative Varikozelenbehandlung bei klinisch relevanter Varikozele,^20,21 eine antibiogrammgerechte Antibiotikatherapie bei Infektionen des Genitaltrakts, Gewichtsreduktion bei Adipositas, Lebensstilmodifikationen sowie die Begrenzung der Exposition gegenüber weiteren Risikofaktoren. Zur Senkung des SDF und zur Erhöhung der Schwangerschaftsraten wird auch eine verkürzte ejakulatorische Abstinenz von 12–24 Stunden empfohlen.

Ergänzend kann eine empirische Behandlung mit Antioxidantien über einen Zeitraum von 3–6 Monate erwogen werden. Die rezent publizierte Untersuchung des Benefits einer antioxidativen Therapie (AOx) für das Eintreten einer Schwangerschaft binnen 6 Monaten schloss leider nur eine Minderheit von 63 auswertbaren Männern unter AOx-Therapie (n=571) für die SDF-Analyse ein. Darüber hinaus war in dieser Studie prinzipiell eine sehr hohe Ausfallsquote bei nur 58% „treatment adherence“ beschrieben.²²

Die Durchführung von ART wird bei erhöhter SDF nicht als primäre Behandlungsstrategie empfohlen. Ist ein ART-Versagen mit erhöhter SDF assoziiert, sollten zunächst die oben genannten Strategien zur Reduktion der SDF umgesetzt werden, bevor ein erneuter ART-Versuch erfolgt.

Global wenden Mediziner:innen heterogene Behandlungspraktiken für Männer mit erhöhter SDF an. Als initiales Vorgehen empfehlen 79,1% Lebensstilmodifikationen und 76,9% verordnen empirisch Antioxidantien.²³ Hinsichtlich der Dauer der Antioxidansgabe empfehlen 39,3% einen Zeitraum von 4–6 Monaten, während 38,1% eine Dauer von 3 Monaten angeben. Der spezifische Benefit einer Antioxidanz-ientherapie wurde in einer Metaanalyse analysiert.²⁴ Zu den Lebensstilmodifikationen zählen das Halten eines gesunden Körpergewichts, Rauchstopp, Vermeidung von Alkoholkonsum, Behandlung genitaler Infektionen sowie die Eliminierung toxischer Expositionen.

Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass für spezifische klinische Konstellationen die therapeutischen Ansätze beträchtlich variieren. Bei Männern mit ungeklärter bzw. idiopathischer Infertilität und erhöhter SDF verweisen die meisten Befragten erst nach einem Zeitraum von 6 Monaten erfolgloser konservativer und empirisch-medikamentöser Behandlung auf reproduktionsmedizinische Maßnahmen. Bei infertilen Männern mit klinischer Varikozele, unauffälligen konventionellen Spermiogrammparametern und erhöhter SDF bieten 31,4% eine Varikozelenreparation unmittelbar nach Diagnosestellung an, während 40,9% dies nach Versagen von Antioxidanzien und konservativen Maßnahmen tun.

Konsistent hingegen zeigen sich die Daten, wonach eine Varikozelektomie, antioxidative Therapie, die Behandlung urogenitaler Infektionen sowie eine erhöhte Ejakulationsfrequenz die SDF senken und Schwangerschaftsergebnisse verbessern können. Metaanalysen mit über 3100 Paaren sowie über 17000 IVF- und ICSI-Zyklen zeigten, dass hohe SDF-Spiegel in ejakulierten Spermien mit einer erhöhten Fehlgeburtswahrscheinlichkeit einhergehen und die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Schwangerschaft nach ART um den Faktor 2,6 reduzieren.^25,26

Fazit

Zusammengefasst besteht nach wie vor ein dringender Bedarf an einheitlichen Empfehlungen der Fachgesellschaften für das Management unfruchtbarer Männer mit erhöhter SDF. Um solche Empfehlungen formulieren zu können, ist belastbare Evidenz erforderlich, die nur durch gut konzipierte Studien gewonnen werden kann. Diese sollten den Nutzen verschiedener Strategien zur Senkung der SDF sowie deren Einfluss auf die reproduktiven Ergebnisse sowohl nach natürlicher Konzeption als auch nach assistierten Reproduktionsverfahren belegen.²³ Das Global Andrology Forum hat sich 2025 dieser Fragestellung im Detail angenommen und in seinen wissenschaftlichen Studien die Basis für ein verbessertes Verständnis der Bedeutung genetischer Alterationen abseits von definierten genetischen Krankheitsbildern erarbeitet.²⁷

Literatur: