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Die Rolle der Liquid Biopsy in der Diagnostik von Tumorerkrankungen
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<p class="article-intro">Die Liquid Biopsy wird nach heutigem Wissensstand die klassische Gewebebiopsie in der initialen pathologischen Routine-Diagnostik nicht komplett ersetzen, doch sie wird in einem integrierten Ansatz dazu beitragen, die Heterogenität des Tumors besser abzubilden, und zusätzliche wichtige Informationen für die Therapieentscheidung mit in den Befund einfließen lassen. Ihr Haupteinsatzgebiet wird sie sicherlich in der Echtzeit- Therapieüberwachung und in der Messung der minimalen Resterkrankung (MRD) von Krebspatienten finden.</p>
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<p class="article-content"><p>Personalisierte Medizin ist ein moderner Begriff und wird sehr gerne auch in marktwirtschaftlicher Hinsicht verwendet. Tatsächlich befinden wir uns heute auf einem guten Weg und kommen dem Ziel, die Biologie der jeweiligen Erkrankung des einzelnen Patienten zu erkennen, näher. Moderne Technologien, wie Next Generation Sequencing (NGS), unterstützen uns in diesem Bestreben. Die Tumorheterogenität hingegen erschwert es uns, die jeweilige Erkrankung bis ins letzte Detail zu analysieren, sodass wir im Verlauf, sei es unter der bisher zielgerichteten Therapie oder therapieinduziert, einen verschieden strukturierten Tumor vorfinden. Um die jeweilige neue Situation im Hinblick auf die Ausgangslage zu beurteilen, bedarf es daher einer exakten Verlaufsanalyse der Tumorerkrankung. Es ist nicht immer möglich, Gewebe zu jedem Zeitpunkt zu gewinnen, daher bietet die Liquid Biopsy uns das Rüstzeug, nur mit einer 5–7 ml-Blutprobe (Abb. 1) und der daraus gewonnenen „zellfreien DNA“ (cfDNA) oder den zirkulierenden Tumorzellen („circulating tumor cells“, CTC) eine Momentaufnahme vorzunehmen. Liquid Biopsy („Flüssigbiopsie) basiert auf dem molekularbiologischen Nachweis von zirkulierender Tumor-DNA in der cfDNA von Körperflüssigkeiten, wie Blut oder Liquor.</p> <p><img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2019_Jatros_Onko_1907_Weblinks_jatros_onko_1907_s49_abb1__obrist.jpg" alt="" width="550" height="459" /></p> <h2>Limitationen der Gewebebiopsie</h2> <p>Der Goldstandard zur Diagnostik von Tumoren ist die histopathologische Befundung der Tumorprobe bzw. der Gewebebiopsie (konventionelle Biopsie). Diese Untersuchung erfolgt mittels histologischer und immunhistologischer (IHC) Analyse nach Paraffineinbettung am Gewebe. Nach Bedarf werden aus der Tumorprobe noch DNA und RNA extrahiert, um ein spezifisches DNA-Mutationsprofil und Genfusionsprofil für den Patienten mittels NGS zu erstellen. Für den Pathologen liegt hierbei ein besonderes Augenmerk auf der Auswahl der richtigen prognostischen und prädiktiven Biomarker für den jeweiligen Tumor. Eine möglichst genaue Charakterisierung des Tumors ist die Basis für gezielte therapeutische Maßnahmen und für die Stratifizierung von Patienten für Therapieentscheidungen. In den letzten Jahren erfolgten zahlreiche Verbesserungen, wie Multiplex-Antikörperfärbungen für Immun- und Differenzierungsmarker (Opal-Substrate), und die Entwicklung hochsensitiver NGS-Panels mit bis zu 500 Genen, die neben der Mutationsanalytik auch noch Informationen zur Mikrosatelliteninstabilität (MSI) und „tumor mutation burden“ (TMB) liefern.<br /> Trotz des Einsatzes von Probenmaterial- sparenden Multiplex-Analysen auf Protein-, DNA- und RNA-Ebene sind Gewebebiopsien nicht nur in der Untersuchungsmaterialmenge limitiert. Eine Gewebebiopsie zeigt meist eine fokale Heterogenität und eine Biopsie aus einer spezifischen Region des Tumors muss daher nicht zwangsläufig die gesamte molekulare Struktur des Tumors repräsentieren. Das bedeutet, nicht erfasste Klone des Tumors können schlussendlich für die Metastasierung und den Tod des Patienten verantwortlich sein. Zudem gibt es Krebserkrankungen, bei denen die Gewinnung von Tumormaterial durch eine Nadelbiopsie oft schwierig bzw. gefährlich ist. Bedingt ist dies meist durch die ungünstige Lokalisation des Tumors, z. B. bei Lungen- oder Hirntumoren, bzw. durch einen schlechten Allgemeinzustand des Patienten, der keinen invasiven Eingriff zur Gewinnung von Untersuchungsmaterial erlaubt. Dies trifft auf ungefähr 20–25 % aller Krebspatienten zu, insbesondere auf Patienten mit kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC). Schlussendlich können an einer Stanzbiopsie meist nicht alle benötigten und erwünschten Untersuchungen durchgeführt werden, da das Material nach wenigen Analysen aufgebraucht ist.</p> <h2>Zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) im Blutplasma</h2> <p>Neben der konventionellen Gewebebiopsie gibt es seit wenigen Jahren auch noch die Methode der Liquid Biopsy („Flüssigbiopsie“). Diese basiert auf dem molekularbiologischen Nachweis von zirkulierender Tumor-DNA in der cfDNA von Körperflüssigkeiten, wie Blut oder Liquor aus dem zentralen Nervensystem. Die Analyse beruht darauf, dass Zellen, die absterben, ihre DNA ins Blut und in die umgebende Körperflüssigkeit abgeben. Diese kurzen DNA-Fragmente, welche das gesamte Genom abdecken, werden als cfDNA bezeichnet. In der nicht invasiven Pränataldiagnostik (NIPT) hat sich die Sequenzierung der fetalen cfDNA schon als hochsensitive und spezifische Methode zur Detektion von Chromosomenanomalien erwiesen. Zufälligerweise konnten bei einigen schwangeren Frauen Mutationen in der cfDNA gefunden werden, die mit dem zeitgleichen Auftreten einer Krebserkrankung einhergingen.<br /> Tumorzellen, welche durch programmierten Zelltod, Hypoxie oder Nekrosen absterben, geben auch ihre fragmentierte DNA ab, welche sich eindeutig von der DNA von gesunden Zellen unterscheidet. Sie enthält Mutationen, Genfusionen und veränderte DNA-Methylierungsmuster spezifisch für Krebszellen, jedoch oft nur in geringen Mengen. Die Detektion von solchen Aberrationen ähnelt einer Suche nach der Nadel im Heuhaufen, wenn man bedenkt, dass sich die fragmentierte Tumor- DNA auf das gesamte Blutvolumen ausverdünnt. Dadurch müssen auch die modernsten DNA-Analytik-Methoden wie „droplet digital PCR“ (ddPCR) und molekulare Barcode-basierende NGS-Assays mit extrem hoher Messtiefe eingesetzt werden, um die wenigen Moleküle der ctDNA verlässlich zu detektieren. Des Weiteren sind die korrekte Abnahme und Verarbeitung der Liquid Biopsy in speziellen Probengefäßen mit negativer Ladung wichtig, um nicht die wenige cfDNA zu absorbieren. Zudem benötigt man ein Fixativ, welches eine Lyse der weißen Blutzellen verhindert. Die Zersetzung von Blutzellen würde zu einer massiven Freisetzung von genomischer DNA führen, und der Nachweis der wenigen ctDNA wäre damit stark beeinträchtigt.</p> <h2>Die Freisetzung der ctDNA variiert je nach Tumorentität und Stadium</h2> <p>Basierend auf den bisherigen Erkenntnissen und Studien scheint die Freisetzung von ctDNA in die Zirkulation sehr stark nach Entität, Lokalisation, Größe, Stadium sowie Vaskularisierung des Tumors zu variieren. Deshalb sind nicht alle Tumorentitäten und Stadien für eine NGSbasierte Analyse der Liquid Biopsy geeignet. Basierend auf vielen retrospektiven Studien scheint die Liquid Biopsy sich für das Monitoring von metastasiertem Kolorektalkarzinom (CRC) und Lungenkarzinom („non small cell lung cancer“, NSCLC) unter Therapie zu bewähren. Hierbei bleibt zu vermerken, dass Liquid Biopsy und Gewebebiopsie als komplementäre, einander ergänzende Verfahren zum Nachweis tumorgenetischer Veränderungen anzusehen sind.<sup>1</sup><br /> Mittlerweile berücksichtigt die aktuelle „S3-Leitlinie zum Lungenkarzinom“ die Liquid Biopsy: „Bei nicht ausreichendem Gewebe für eine molekulare Diagnostik, und wenn eine erneute Biopsie nicht mit vertretbarem Risiko durchgeführt werden kann, soll eine Liquid Biopsy in Betracht gezogen werden“, sowie: „Bei akquirierter EGFR-TKI-Resistenz und negativer Biopsie in Bezug auf T790M soll zusätzlich eine Liquid Biopsy zur Bestimmung von Resistenzmechanismen durchgeführt werden“.<sup>2</sup><br /> Auch in der S3-Leitlinie zum CRC findet man einen Vermerk auf die Liquid Biopsy: „Falls die Bestimmung des <em>RAS</em>-Mutationsstatus aus dem Gewebe nicht möglich ist, kann in Betracht gezogen werden, den<em> RAS</em>-Mutationsstatus aus der im Blut zirkulierenden Tumor-DNA zu ermitteln“.<sup>3</sup></p> <h2>ctDNA beim fortgeschrittenen NSCLC</h2> <p>Basierend auf einer retrospektiven NGS-basierten Studie mit wenigen Genen mit NSCLC-Patienten und gesunden Probanden von Alborelli et al.<sup>4</sup>, welche dieses Jahr auf der EACR-ESMO Joint Conference on Liquid Biopsies präsentiert wurde<sup>5</sup>, zeigt sich eine hohe Vergleichbarkeit zwischen Liquid Biopsy und Gewebebiopsie, sowohl in der initialen Diagnose (88 % ) als auch im Monitoring (72 % ) der Treibermutation bei Lungenkarzinompatienten. Die Autoren schließen aus dieser Studie, dass die Liquid Biopsy komplementär zur Gewebebiopsie sowohl für den Nachweis einer Mutation als auch für ein Monitoring unter Therapie einen klinischen Nutzen hat.<br /> Interessanterweise veränderte sich die ctDNA bei den Patienten übereinstimmend mit dem klinischen Verlauf der Erkrankung, wie Riediger et al. 2016 in einer ddPCR-basierten Studie zeigen konnten.<sup>6</sup> Zu Beginn einer Tyrosinkinase- Inhibitor(TKI)-Therapie erfolgt meist ein Anstieg der ctDNA, was auf ein gutes Therapieansprechen und abgestorbene Krebszellen hindeutet, später gibt es einen kontinuierlichen Abfall – beim Ansprechen auf die Therapie –, bis keine ctDNA im Blutplasma mehr nachzuweisen ist. Bei Patienten, deren Tumor rezidiviert, gibt es in kurzen Zeitabschnitten einen Anstieg der ctDNA-Konzentration, in der Liquid Biopsy sogar schon vor dem Auftreten klinischer Anzeichen.<br /> 2017 konnten Chaudhuri et al. in einer retrospektiven Studie von Lungenkarzinompatienten unter Erstlinientherapie zeigen, dass die ctDNA-Analyse schon fünf Monate vor bildgebenden Verfahren einen Relaps des Patienten detektieren kann und somit die Möglichkeit einer früheren Intervention bietet, das heißt zu einem Zeitpunkt, zu dem die Tumormasse noch gering ist.<sup>7</sup></p> <h2>ctDNA beim fortgeschrittenen CRC</h2> <p>Ähnlich wie beim Lungenkarzinom hat die Liquid Biopsy mittlerweile auch einen Stellenwert im Monitoring von CRC unter Therapie.<br /> Im Rahmen der Anti-EGFR(„epidermal growth factor receptor“)-Therapie beim CRC bilden sich bei ca. 50 % der Patienten Resistenzen aufgrund von <em>RAS</em>-Mutationen aus, welche eine erneute Anpassung der Therapie erforderlich machen. Auf Basis bisheriger zum Monitoring verwendeter Methoden wird die Entwicklung von Resistenzen jedoch häufig erst sehr spät erkannt. Durch die Liquid Biopsy (ddPCRRAS- Mutationsanalyse) konnte in einer retrospektiven Studie von Misale et al. (2012) frühzeitig eine Resistenzentwicklung noch während einer bestehenden Therapie erkannt werden, und dies durchschnittlich drei Monate früher als mit bildgebenden Verfahren.<sup>8</sup><br /> Dieser signifikante Vorteil konnte auch von Schøler et al. 2017 in einer späteren longitudinalen Studie mit Liquid- Biopsy-Proben bei metastasierten CRC bestätigt werden.<sup>9</sup> Die ctDNA-Positivität ist somit dem bildgebenden Verfahren (Computertomografie) um Monate voraus.<br /> 2018 konnte auch erstmalig in einer prospektiven Studie von García-Foncillas et al. mit 92 % eine sehr hohe Übereinstimmung zwischen auf Gewebebiopsie und auf Liquid Biopsy basierender RAS-Mutationsanalyse bei metastasierten CRC erzielt werden.<sup>10</sup></p> <h2>Schlussfolgerung und Ausblick</h2> <p>Den größten klinischen Benefit hat die ctDNA-Testung bei fortgeschrittenen Tumoren wie CRC und NSCLC und nicht in der Erstdiagnose von Tumoren. Diese Tumorentitäten setzen viel ctDNA frei und machen ein gezieltes engmaschiges Monitoring möglich, das aber in sinnvollen Intervallen in Bezug auf die Tumorbiologie erfolgen sollte.<br /> Idealerweise sollte ein NGS-basiertes Monitoring mit einer großen Auswahl von Genen erfolgen, neben den wichtigsten Treibergenen des Tumors sollten auch „hot spots“, die häufigsten Mutationen der Tumor-DNA, erfasst werden. Große Genpanels mit über 70 Genen resultieren in einer höheren Wahrscheinlichkeit, die Gesamtheit der ctDNA und damit der Tumorerkrankung abzubilden. Somit können auch Veränderungen der klonalen Struktur des Tumors von Patienten unter Therapie sichtbar gemacht werden, z. B. Veränderungen der Klonzusammensetzung im Lauf der Zeit. Hierfür benötigt man jedoch eine entsprechende Messtiefe, was die Tumor-DNA-Analyse unter Umständen recht kostenintensiv gestaltet. Neben der erforderlichen Zeit von bis zu einer Woche von der technischen Durchführung bis zum fertigen Befund benötigt man entsprechend geschultes Personal, eine leistungsstarke Computerumgebung und validierte Softwarelösungen zum Berechnen der Mutationen. Schlussendlich muss man noch die hohen Datenmengen speichern. Somit wird nicht jedes Routinelabor solche Untersuchungen durchführen können. Darauf spezialisierte Zentren, die den nötigen Probendurchsatz und eine ebensolche Erfahrung haben, sind die geeigneten Anbieter für die ctDNA-Testungen. Mit zunehmender Datenlage, insbesondere aus prospektiven randomisierten klinischen Studien mit großen NGS-Panels, werden sich die Vorteile der ctDNA beim Monitoring von fortgeschrittenen NSCLC und CRC gegenüber bildgebenden Verfahren wahrscheinlich noch weiter herauskristallisieren. Somit könnte bei problematischer Befundung durch den Radiologen, insbesondere nach postoperativen Wundheilungs- und Entzündungsprozessen, die ctDNA-Analyse eine große Hilfe für das Monitoring und für die Stratifizierung des Patienten sein.</p></p>
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<a class="literatur" data-toggle="collapse" href="#collapseLiteratur" aria-expanded="false" aria-controls="collapseLiteratur" >Literatur</a>
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<p><strong>1</strong> Jung A, Kirchner T: Liquid Biopsy in der tumorgenetischen Diagnostik. Dtsch Arztebl Int 2018; 115(10): 169-74 <strong>2</strong> AWMF online: S3-Leitlinie Prävention, Diagnostik, Therapie und Nachsorge des Lungenkarzinoms. Langversion 1.0, Februar 2018, AWMF-Registernummer: 020/007OL. Abgerufen am 5. November 2019 unter: https://www. awmf.org/uploads/tx_szleitlinien/020-007OL_l_S3_Lungenkarzinom_ 2018-03.pdf <strong>3</strong> AWMF online: S3-Leitlinie Kolorektales Karzinom. Langversion 2.1, Jänner 2019, AWMF-Registernummer: 021/007OL. Abgerufen am 5. November 2019 unter: https://www.awmf.org/uploads/tx_ szleitlinien/021-007OLl_S3_Kolorektales-Karzinom- KRK_2019-01.pdf <strong>4</strong> Alborelli I et al.: Cell-free DNA analysis in healthy individuals by next-generation sequencing: a proof of concept and technical validation study. Cell Death Dis 2019; 10(7): 534 <strong>5</strong> Tucker N: 2019: Liquid biopsy complements tissue biopsy in NSCLC management. Targeted Oncology; abgerufen am 5. November 2019 unter: https://www.targetedonc.com/news/liquid-biopsy-complements- tissue-biopsy-in-nsclc-management <strong>6</strong> Riediger AL et al.: Mutation analysis of circulating plasma DNA to determine response to EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy of lung adenocarcinoma patients. Sci Rep 2016; 6: 33505 <strong>7</strong> Chaudhuri A et al.: Early detection of molecular residual disease in localized lung cancer by circulating tumor DNA profiling. Cancer Discov 2017; 7(12): 1394-403 <strong>8</strong> Misale S et al.: Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature 2012; 486(7404): 532-6 <strong>9</strong> Schøler L et al.: Clinical implications of monitoring circulating tumor DNA in patients with colorectal cancer. Clin Cancer Res 2017; 23(18): 5437-545 <strong>10</strong> García-Foncillas J et al.: Prospective multicenter real-world RAS mutation comparison between OncoBEAM-based liquid biopsy and tissue analysis in metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 2018; 119(12): 1464-70</p> <p>Und bei den Verfassern</p>
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