Tc-MDP-Labeling

Eine neue Methode zur nicht destruktiven Evaluation des osteogenen Potenzials mesenchymaler Stammzellen

Jatros

Autor:

Prof. Dr. Tobias Gotterbarm

Universitätsklinik für Orthopädie und Traumatologie, Kepler Universitätsklinikum, Johannes Kepler Universität Linz E-Mail: tobias.Gotterbarm@kepleruniklinikum.at

Autor:

Dr. Tobias Großner

Zentrum für Orthopädie, Unfallchirurgie und Paraplegiologie, Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie, Universitätsklinikum Heidelberg E-Mail: tobias.grossner@med.uni-heidelberg.de

13.02.2020

Gängige Methoden, um die erfolgreiche Osteogenese bei in vitro differenzierten mesenchymalen Stammzellen (MSC) zu bestätigen, sind aufwendig, kostspielig und zerstören die Zellkultur. Seit Kurzem steht eine neue, nicht destruktive und äußerst sensitive Methode zur Verfügung, die es ermöglicht, das osteogene Potenzial von MSC in der Monolayer- und 3D-Kultur anhand der Quantifikation der Menge an synthetisiertem Hydroxylapatit zu bestimmen. <hr /> Osteogene Differenzierung von mesenchymalen und anderen Stammzellen gehört heutzutage zu den Standardverfahren des modernen &bdquo;bone tissue engineering“.1, 2 Hierbei gibt es unterschiedliche chemische und physikalische Möglichkeiten, wodurch die Zellen angeregt werden, sich in die osteogene Linie zu entwickeln und dadurch osteogenspezifische Proteine wie Osteokalzin und Osteonektin zu exprimieren und gleichzeitig eine anorganische mineralisierende Matrix zu synthetisieren, die aus Hydroxylapatit (Ca10[PO4]6[OH]2) besteht.3–5 Das ursprünglich von Jaiswal et al. entwickelte Differenzierungsverfahren beruht auf chemischer Induktion mittels Zugabe von Dexamethason, Ascorbinsäure und β-Glycerolphosphat zu einem basalen Zellkulturmedium.6 Hierdurch lässt sich innerhalb von 21 Tagen eine sichere osteogene Differenzierung von pluripotenten mesenchymalen Stammzellen erreichen. Um den Nachweis der erfolgreichen Differenzierung zu erbringen, wird als Goldstandard bis heute die positive Färbung mit dem Farbstoff Alizarinrot angesehen. Hierbei kommt es zur Interaktion des Farbstoffs mit den im Hydroxylapatit vorhandenen Kalziumionen und dadurch zum Farbumschlag.7 Dieses Verfahren wird von der International Society for Cellular Therapy neben der Färbung nach von Kossa als einziges valides Verfahren angesehen, um die Osteogenese nachzuweisen. Zusammen mit der chondro- und adipogenen Differenzierung sind so die Mindestkriterien erfüllt, um die &bdquo;Pluripotenz“ bei mesenchymalen Stromazellen zu bestätigen.8 Neben dem Nachweis der anorganischen Matrix des Hydroxylapatits gibt es auch andere Verfahren, um die erfolgreiche In-vitro-Osteogenese zu überprüfen und gegebenenfalls auch zu quantifizieren. Hierbei kommt dem Nachweis der Knochenproteine ein hoher Stellenwert zu. Während 90 % der Proteine auf die Kollagene entfallen, die die Grundstruktur der Matrix bilden, entfallen 10 % auf die sogenannten &bdquo;non-collagen proteins“ (NCP), welche in 5 großen Gruppen zusammengefasst werden können: 1) Proteoglykane und Glykosaminoglykane, 2) Glykoproteine, 3) SIBLING-Proteine, 4) Osteokalzin, 5) Osteonektin (SPARC), wobei wahrscheinlich der Kalziumtransporter alkalische Phosphatase aus der Gruppe der Glykoproteine das bekannteste Knochenprotein darstellt.9 Die NCP können durch ELISA oder immunhistochemisch nachgewiesen werden. Weitere Methoden, um die erfolgreiche Osteogenese bei in vitro differenzierten MSC zu bestätigen, sind Röntgendiffraktionsanalyse, Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma, Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der energiedispersiven Röntgenspektroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie und μCT.10–17 Jedoch sind sämtliche dieser Methoden recht aufwendig durchzuführen und kostspielig. Noch dazu weisen sie die Osteogenese zum Teil nur qualitativ und nicht quantitativ nach und zerstören die jeweilige Zellkultur.16, 17 Dies ist nicht zuletzt darin begründet, dass ständig neue Verfahren zur In-vitro-Osteogenese veröffentlicht werden, welche schnell, vergleichbar und sensitiv getestet werden sollten, da nur so die effektivsten Methoden gefunden werden können, um das zerstörte Knochengewebe wieder zu heilen. Insbesondere soll dabei das individuelle Potenzial der patienteneigenen Stammzellen definiert werden, um beim &bdquo;bone tissue engineering“ die wirkungsvollsten Verfahren zur Behandlung von großen Knochendefekten und Pseudarthrosen anbieten zu können. Zur Behandlung solcher Defekte wird die Transplantation von autologer Spongiosa, zumeist aus dem Beckenkamm, dem Tibiaplateau oder dem distalen Radius, als Goldstandard angesehen – dies allerdings zulasten der sogenannten &bdquo;donor site morbidity“, welche u. a. durch postoperative Schmerzen, Blutungen, Infektionen sowie Nervenschäden charakterisiert ist.18 Optimal wäre daher eine Zellquelle für mesenchymale Stammzellen, welche &bdquo;off the shelf“ verfügbar ist und nicht die negativen Eigenschaften der &bdquo;donor site morbidity“ aufweist, da das therapeutisch-regenerative Potenzial von mesenchymalen Stammzellen als sehr hoch angesehen wird. Auch wenn bisher erst kleinere Patientenkollektive durch dieses Verfahren behandelt wurden, ist die Heilungsrate durch MSC überdurchschnittlich hoch,19 da neben der Synthese der anorganischen Matrix diese Zellen weitere wesentliche Eigenschaften aufweisen: Durch das Sezernieren von Wachstumsfaktoren und andere Chemokine wird eine verstärkte Zellproliferation und Angiogenese auf autokrinen und parakrinen Wegen erreicht.20–22 Gleichzeitig reagieren MSC auf Entzündungsreize und Zytokine (IL-1, IL-2, IL-12, TNF-alpha, Interferon gamma) mit Antiinflammation und Immunmodulation und es kommt zur Sezernierung von Zytokinen wie Prostaglandin 2, TGF-β1, HGF, SDF-1, Stickstoffoxid, Indolamin-2,3-Dioxygenase, IL-4, IL-6, IL-10, IL-1-Rezeptor-Antagonist und TNF-alpha-Rezeptor.23–25 Hierdurch üben die MSC einen antientzündlichen Reiz auf T-Zellen, natürliche Killerzellen, B-Zellen, Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen aus. Bisher ist es unterschiedlichen Forschungsgruppen gelungen, pluripotente Zellen nicht nur aus dem Knochenmark, sondern auch aus anderen Geweben zu isolieren und erfolgreich osteogen zu induzieren.26 Um das osteogene Potenzial der verschiedenen Zellquellen und Methoden schnell, sensitiv und effizient zu untersuchen, steht seit Kurzem eine neue, nicht destruktive und äußerst sensitive Methode zur Verfügung, die sich die Eigenschaft des radioaktiven Elements Technetium in Verbindung mit einem Polyphosphonat zunutze macht, sich selektiv an neu synthetisiertes Hydroxylapatit anzulagern.27, 28 In der klinischen Medizin wird dieses Verfahren seit den 1970er-Jahren als Knochenszintigrafie bezeichnet und angewendet, um im menschlichen Körper Areale mit verstärkter Knochenstoffwechselaktivität zu identifizieren. Hierbei kommt es in vivo zum Phänomen der Chemisorption der Polyphosphonate Methylendiphosphonat (MDP), Hydroxymethylendiphosphonat (HDP) oder 2,3-Dicarboxypropan-1,1-Diphosphonat (DPD) am neu synthetisierten Hydroxylapatit, wobei das kovalent an das Polyphosphonat gebundene metastabile Isotop des Technetiums (99m) mit einer kurzen Halbwertszeit von 6,01 Stunden eine charakteristische Gammastrahlung mit einer Energie von 140 keV emittiert, welche die Darstellung mittels einer Gammakamera möglich macht.29–31 Dass dieses Verfahren auch in vitro zur Quantifikation des osteogenen Potenzials von mesenchymalen Stammzellen angewendet werden kann, konnte erstmal 2008 gezeigt werden.32 Hierfür wurden humane mesenchymale Stammzellen expandiert und im Monolayer auf Petrischalen (35 mm Durchmesser) über 21 Tage in osteogenem Medium kultiviert (Abb. 1). Eine negative Kontrollgruppe in Standardmedium wurde parallel mitgeführt. Anschließend erfolgte die Applikation des in 0,9 %-NaCl-Lösung gelösten Tracers 99mTc-MDP (5,5 MBq) direkt in die Zellkulturschale. Nach einer Einwirkzeit von 2 Stunden wurden die Schalen gewaschen, um den ungebundenen Tracer zu entfernen, und dann unter einer Gammakamera platziert, welche normalerweise in der klinischen Medizin zum Einsatz kommt (Abb. 2). Die Akquisition der Gammastrahlung erfolgte in Form von sogenannten Gamma-Counts auf einem 265 x 265er-Raster über einen Zeitraum von 180 Sekunden. Anschließend wurden die Daten analysiert, indem um die jeweiligen Schalen &bdquo;regions of interest“ (ROI) definiert wurden und die Gamma-Counts in diesen Bereichen berechnet wurden (Abb. 3, 4). Die Ergebnisse wurden mit dem Student’s t-Test analysiert und zeigten einen signifikant höheren Uptake des radioaktiven Tracers innerhalb der osteogenen Gruppe (p = 0,008; Abb. 5, 6). Zur Validierung der Methode wurden die Zellkulturen, die zuvor mit dem radioaktiven Tracer inkubiert worden waren, mit Alizarinrot-Lösung gefärbt, da dieses Verfahren weiterhin als Standard der osteogenen Quantifikation angesehen wird.11 Da es sich beim 99mTc-MDP-Labeling um ein nicht destruktives Verfahren handelt, konnte problemlos dieselbe Zellkultur verwendet werden. Der Farbstoff wurde dann wieder extrahiert und die Konzentration photometrisch bestimmt. Die Ergebnisse wurden mittels Korrelationsanalyse nach Spearman mit den Ergebnissen des 99mTc-MDP-Labelings verglichen und es konnte eine positive mittlere Korrelation der Daten mit einem Korrelationskoeffizienten von r = 0,637 berechnet werden. Die Korrelation war auf einem Niveau von p = 0,026 signifikant. Die Ergebnisse legten die Vermutung nahe, dass das Verfahren auch bei einer dreidimensionalen Zellkultur angewendet werden kann. Dies stellte in der Vergangenheit immer eine große Herausforderung dar, da es nur mit invasiven/destruktiven Methoden möglich war, das osteogene Potenzial auch im Inneren der Kultur valide zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden Kollagen-II-Scaffolds mit einem Durchmesser von 8 mm produziert, mit einer Million MSC besiedelt und über 21 Tage osteogen kultiviert. Erneut wurde eine negative Kontrollgruppe parallel mitgeführt. Nach Abschluss der Zellkultur zeigten sich die osteogenen Scaffolds kondensierter und fester als die Scaffolds der Kontrollgruppe. Für das 99mTc- MDP-Labeling wurden die Scaffolds in 2,5 ml-Eppendorf- Tubes gelegt und mit 1 ml Tracerlösung inkubiert. Der Tracer hatte eine Aktivität von 20 MBq. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden wurden die Scaffolds dreimal in PBS gewaschen und dann in den Tubes direkt auf den Detektor der Gammakamera gelegt (Abb. 7). Nach einer Akquisitionszeit von 180 Sekunden erfolgte die Auswertung analog zu den Monolayerkulturen (Abb. 8). Die Scaffolds wurden im Anschluss histologisch aufgearbeitet und mit Alizarinrot gefärbt. Der Student’s t-Test zeigte erneut einen signifikant höheren Uptake für die osteogen kultivierten Scaffolds (p = 0,048; Abb. 9, 10). Die histologische Färbung konnte ebenfalls ausschließlich für diese Gruppe einen positiven Kalziumnachweis erbringen. Durch diese neuartige Methode ist es nun möglich, das osteogene Potenzial mesenchymaler Stammzellen anhand der Quantifikation der Menge an synthetisiertem Hydroxylapatit zu bestimmen. Diese Methode bietet diverse Vorteile gegenüber den bestehenden Verfahren, wobei als wesentliches Charakteristikum hervorgehoben werden muss, das das 99mTc-MDP-Labeling ein nicht destruktives Verfahren ist, was bedeutet, dass die Zellkulturen nach Abschluss der Quantifikation für weitere Experimente zur Verfügung stehen und dass der Nachweis direkt am synthetisierten Produkt erfolgt, was der entscheidende Parameter für eine potenzielle Anwendung in vivo darstellt. Auch lassen die erhobenen Daten vermuten, dass dieses innovative Verfahren äußerst sensitiv für den Nachweis von Hydroxylapatit ist.27, 28 Die Gammastrahlung, welche von den Kulturen ausgeht, ist als Gesundheitsrisiko für den Untersucher zu vernachlässigen. Obwohl 99mTc eine geringe HWZeff hat, kommt es bei seiner Anwendung natürlich zu einer Freisetzung von Radioaktivität. In der klinischen Medizin lässt sich eine definierte Strahlenexposition für Patienten sowie das medizinische Personal aufgrund der therapeutischen und/oder diagnostischen Wertigkeit rechtfertigen. Für eine routinemäßige Knochenszintigrafie werden dem Patienten ca. 500 MBq 99mTc zur Diagnostik benigner und ca. 700 MBq 99mTc zur Diagnostik maligner Prozesse injiziert. Hieraus resultiert für den Patienten eine effektive Dosis von ca. 2,9 bzw. 4,1 mSv je Untersuchung. Die natürliche, zivilisatorische Strahlenexposition für eine Person/ pro Jahr beträgt in der Bundesrepublik Deutschland etwa 4,0 mSv/a und entspricht damit einer einmaligen Knochenszintigrafie mit 99mTechnetium. Die Zellkulturen bei In-vitro-99mTc-MDP-Labeling weisen relativ geringe Aktivitäten von lediglich 5,5 bis 20 MBq je Labeling auf.30, 33 Durch eine zukünftige Weiterentwicklung und Verfeinerung des Verfahrens, z. B. durch den Einsatz anderer Tracer, ist die Möglichkeit eines breiten Einsatzes beim Knochen- Tissue-Engineering und bei der Validierung des osteogenen Potenzials von patientenindividuellen mesenchymalen Stammzellen potenziell gegeben. <img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2020_Jatros_Ortho_2001_Weblinks_s31_abb123.jpg" alt="" width="850" height="286" /> <img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2020_Jatros_Ortho_2001_Weblinks_s31_abb4.jpg" alt="" width="600" height="344" />   <img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2020_Jatros_Ortho_2001_Weblinks_s31_abb5.jpg" alt="" width="600" height="398" /> <img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2020_Jatros_Ortho_2001_Weblinks_s31_abb6.jpg" alt="" width="500" height="533" /> <img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2020_Jatros_Ortho_2001_Weblinks_s31_abb7.jpg" alt="" width="300" height="279" /> <img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2020_Jatros_Ortho_2001_Weblinks_s31_abb8.jpg" alt="" width="300" height="389" /> <img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2020_Jatros_Ortho_2001_Weblinks_s31_abb9.jpg" alt="" width="650" height="415" /> <img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2020_Jatros_Ortho_2001_Weblinks_s31_abb10.jpg" alt="" width="500" height="528" />   <a class="literatur" data-toggle="collapse" href="#collapseLiteratur" aria-expanded="false" aria-controls="collapseLiteratur" >Literatur</a> <div class="collapse" id="collapseLiteratur"> 1 Buda R et al.: Musculoskelet Surg 2013; 97(2): 145-51 2 Centeno CJ, Freeman MD: Wien Med Wochenschr 2013; 164(5-6): 83-7 3 Taguchi YM et al.: Proc Assoc Am Physicians 1998; 110(6): 559-74 4 Thomas T et al.: Endocrinology 1999; 140(4): 1630-8 5 Rawadi G et al.: J Bone Miner Res 2003; 18(10): 1842-53 6 Jaiswal N et al.: J Cell Biochem 1997; 64(2): 295-312 7 Gilmore SK et al.: Stain Technol 1986; 61(2): 89-92 8 Dominici M et al.: Cytotherapy 2006; 8(4): 315-7 9 Burr DB, Allen MR: Basic and applied bone biology. 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