Phagentherapie: mit manipulierten Viren Bakterien bekämpfen

Der Einsatz von Phagen gegen pathogene Bakterien wurde bereits vor der Entwicklung der ersten Antibiotika versucht. In Zeiten zunehmender Antibiotikaresistenzen wird der Phagentherapie aktuell wieder größeres Interesse entgegengebracht. Dieser Trend wird unterstützt durch die Entwicklung der Biotechnologie, die es nun möglich macht, alte Probleme der Phagentherapie zu lösen.

Die antibiotische Krise infolge zunehmender bakterieller Resistenzen wird in den kommenden Jahren weltweit eine enorme Zahl von Todesopfern fordern. Bis zum Jahr 2050 könnten dieOpferzahlen von aktuell 700000 auf 10 Millionen steigen, so Prof. Dr. Martin J. Loessner, Mikrobiologe an der Eidgenössischen Technischen Hochschule (ETH) Zürich. Allerdings geben zahlreiche neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie Anlass zur Hoffnung. Dies betrifft nicht zuletzt Neuentwicklungen auf dem Gebiet der Phagentherapie sowie der von den Bakteriophagen codierten Endolysine.

Bakteriophagen sind seit mehr als 100 Jahren bekannt. Ebenso alt ist das Konzept, diese Viren gezielt gegen Bakterien einzusetzen. Phagen docken an Bakterien an und injizieren ihre DNA in die Zelle. Damit induzieren sie die Produktion ihrer Kopien im Bakterium, die schließlich zu dessen Tod und zur Freisetzung der neuen Phagen führt. Phagen sind die einzigen Viren, die im Zuge ihrer Replikation nicht komplett in die Wirtszelle eindringen, erläuterte Loessner.

Listerienkiller: Viren im Dienste der Lebensmittelsicherheit

Phagen kommen mittlerweile sowohl in der Biokontrolle als auch in der Therapie zum Einsatz. Von Biokontrolle spricht man laut Loessner überall dort, wo es nicht um medizinische Fragestellungen geht. Beispielsweise ist der Phage A511 hocheffizient im Abtöten von Listerien, insbesondere der pathogenen Stämme 1, 2 und 4. Dies muss allerdings im Lebensmittel erfolgen, da der Phage nicht mehr an die intrazellulär lebenden Listerien herankommt, wenn diese bereits einen Menschen infiziert haben. Wird A511 im Zuge der Käsereifung zugesetzt, so verschwinden etwaige vorhandene Listerien innerhalb von Stunden vollständig. Dieses und ähnliche Verfahren sind in großen Teilen der Welt zugelassen und in Verwendung. Einzige Ausnahme bildet die EU, wo sich die maßgeblichen Stellen seit mehr als 20 Jahren querlegen, so Loessner. Einige Länder haben diese übernationalen Regelungen an Brüssel vorbei gelöst, andere, darunter Österreich, haben nach wie vor Bedenken.

Die Phagentherapie, also der Einsatz von Phagen in der Medizin, geht bereits auf die 1920er-Jahre zurück, geriet angesichts des Siegeszugs der Antibiotika in den 1930er- und 1940er-Jahren jedoch weitgehend in Vergessenheit. Erst mit dem Auftreten der ersten multiresistenten Bakterienstämme erwachte das Interesse an Phagen aufs Neue. Loessner: „In den vergangenen Jahren konnten wir einen steilen Anstieg erfolgreicher Anwendungen beobachten. Belgien und nun auch Portugal haben die Phagentherapie nun offiziell zugelassen.“

Die Anforderungen an Phagen

Phagentherapie gilt mittlerweile als sehr sicher.¹ Zu den Anwendungsgebieten zählen Weichteilinfektionen, topische Infektionen, Brandwunden oder Schleimhautinfektionen. Die Methoden und Techniken der modernen Mikrobiologie erlauben heute eine wesentlich zielsicherere Auswahl der Viren als noch vor wenigen Jahren. Phagen sollen ein breites Keimspektrum abdecken und ausschließlich lytische Aktivität zeigen, was bedeutet, dass sie sich nicht in das bakterielle Genom integrieren können. Phagen für den Einsatz in Menschen müssen zuvor vollständig sequenziert werden. Dabei müssen Virulenzfaktoren sowie potenzielle Humanpathogenität ausgeschlossen werden. Auch dürfen Phagen keine laterale Transduktion bakterieller DNA verursachen. Dies könnte nämlich dazu führen, dass beispielsweise Gene, die für bestimmte Toxine codieren, durch die Therapie verbreitet werden. Loessner: „Wenn man da nicht vorsichtig ist, öffnet man Pandoras Büchse.“

Weitere Anforderungen an Phagen für den klinischen Einsatz sind unter anderem die Möglichkeit, große Mengen zu produzieren, ausreichende Stabilität und letztlich die Zulassung durch die Regulationsbehörden. Letztere stellt eine erhebliche Hürde dar. Loessner: „Man kann das nicht einfach machen – außer vielleicht in Fällen von ‚compassionate use‘.“

Phagen gezielt herstellen

Zahlreiche Faktoren erschweren die Auswahl geeigneter Phagen. Viele sind auf eine sehr enge Auswahl an Wirten spezialisiert oder ihren Wirten gegenüber relativ gutmütig. Letzteres habe einen evolutionsbiologischen Hintergrund, erläuterte Loessner. Phagen, die alle infrage kommenden Wirte schnellstmöglich töten, haben letztlich einen Selektionsnachteil. Auch kann es relativ schnell zur Resistenzbildung seitens des Wirtes kommen.

Moderne Technologie kann allerdings diese Probleme umgehen, indem man davon abgeht, Phagen aus der Natur zu identifizieren, sondern sie lieber mittels „genom engineering“ quasi nach Maß herstellt. Loessner: „Es geht darum, die Viren so zu verändern, dass sie gewünschte Eigenschaften aufweisen.“

Dazu gibt es zwei Techniken: Die klassische Methode beruht auf einem Bakterium, in welches das gewünschte Phagengen eingebracht wird. Wird dieses Bakterium mit Phagen infiziert, so kommt es zur Rekombination, bei der das Gen in einige der neu produzierten Phagen gelangt. Nachteil dieser Methode ist die sehr geringe Ausbeute an modifizierten Viren. Eine modernere Methode beruht auf Isolation der Phagen-DNA, deren Modifikation und anschließender Reaktivierung der Phagen mit veränderter DNA. Diese Technologie steht erst seit wenigen Jahren zur Verfügung und erlaubt die Produktion von Phagen mit theoretisch beliebig veränderbarer Erbsubstanz in einer Zeit von lediglich sechs bis zehn Tagen.

Ein Beispiel dafür ist die Modifikation temperenter Phagen, die aufgrund einer lysogenen Kontrollregion im Genom eher zum Einbau in die Erbsubstanz des Bakteriums als zur Lyse tendieren. Die Entfernung dieser Kontrollregion macht den Phagen virulent. Diese Veränderung lässt sich noch verstärken, wenn zusätzliche Bewaffnung eingebracht wird. Beispielsweise durch Gene, die den Phagen bei der Zerstörung der bakteriellen Zellwand unterstützen. Eine derartige Modifikation eines Phagen, dessen Wildtyp die Keimzahl einer Bakterienkultur nur leicht reduziert, führt schließlich zur kompletten Zerstörung dieser Kultur.²

Die Grenze dieser Methode wird durch die Größe des Phagengenoms definiert, die bei einigen dieser Viren bis zu mehr als 200000 Basen beträgt. Ab einer Größe von 70000 bis 80000 Basen stößt die Synthese des Genoms auf Probleme. Hier bietet die Genschere CRISPR-Cas9 Abhilfe. Loessner: „Ein CRISPR-Enzym ist eine genetisch programmierbare Nuklease. Sie schneidet nur an einer einzigen, definierten Stelle. Wir haben CRISPR-Enzyme so programmiert, dass sie Wildtyp-Phagen zerschneiden und nur den genetisch manipulierten Phagen übrig lassen. So können wir sehr schnelle Selektion erreichen.“ Mithilfe dieser Techniken ist es gelungen, einen Phagen herzustellen, der nicht nur Listerien abtötet, sondern dabei auch das Enzym Lysostaphin produziert, das die Zellwand von Staphylokokken zerstört.³ Loessner: „Das ist etwas, das es in der Natur nicht gibt. Es gibt keinen natürlich vorkommenden Phagen, der zwei so unterschiedliche Bakterien angreifen kann.“

Die Phagentherapie auf dem Weg (zurück) in die Klinik

Klinische Studien mit solchen Phagen sind beispielsweise in der Indikation katheterassoziierter Infektionen des Urogenitaltrakts (CAUTI) in Vorbereitung. Ein Problem dieser Infektionen liegt darin, dass sie häufig polymikrobiell sind und unterschiedliche grampositive und gramnegative Pathogene gleichzeitig involviert sein können. Die häufigsten Erreger sind Enterococcus faecalis, Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae. An der ETH Zürich wurden für die Therapie dieser Infektionen sogenannte „self-targeting HEPT“ („heterologous effector phage therapeutics“) entwickelt, die neben der Phagenaktivität auch durch die Produktion von Enzymen bakterizid wirksam sind. Auf diesem Weg sollen auch die wenigen Bakterien, die sich durch Resistenzbildung den Phagen entziehen können, eliminiert werden.

Dass das funktioniert, wurde beispielsweise für den Phagen E2::colE7 gezeigt, der nicht nur durch Infektion E. coli abtötet, sondern dabei auch ein Colizin – eine Nuklease, die Bakterien von außen angreift – freisetzt. Auf diesem Weg wird verhindert, dass sich die Bakterienpopulation nach initialer hoher Phagenaktivität infolge von Resistenzbildung erholen kann. Mit diesem Phagen gelingt innerhalb weniger Stunden eine vollständige und anhaltende Eradikation von E. coli. Vergleichbare Ergebnisse werden für den Phagen K1::kvarM in der Bekämpfung von Klebsiella pneumoniae berichtet.⁴ Diese Phagen sollen nun in Zusammenarbeit mit der Universitätsklinik Zürich in einer Humanstudie mit 300 Patient:innen untersucht werden. Die Auflage von Swissmedic war lediglich „good manufacturing practice“ (GMP), die Verwendung gentechnisch manipulierter Phagen wurde akzeptiert.

Einen Schritt über „self-targeting HEPT“ hinaus stellt „cross-targeting HEPT“ dar. Dabei kommt es im Zuge der Abtötung eines Zielbakteriums zur Freisetzung von Faktoren, die auch andere Bakterien töten. Damit kann das Wirkspektrum eines Phagen erheblich erweitert werden. Im Zuge des CAUTI-Projekts wurden Phagen entwickelt, die gegen Enterokokken aktiv sind und zusätzlich E. coli oder K. pneumoniae abtöten. Ein weiterer Phage mit Aktivität gegen E. coli tötet zusätzlich E. faecalis.⁴ Loessner: „Genau das ist es, was wir in der Behandlung polymikrobieller Harnwegsinfektionen brauchen.“

Weiterentwicklungen

Eine weitere potenzielle Anwendung genetisch manipulierter Phagen ist die Immunmodulation. Durch entsprechend manipulierte Phagen (ImmunoPhage) können nicht nur pathogene Bakterien infiziert, sondern im Zuge von deren Abtötung auch immunmodulatorische Peptide freigesetzt werden, die zu einer Stimulation des Immunsystems führen. Als Immuneffektoren eignen sich bestimmte Interleukine, Interferone oder Chemokine. Ziel ist eine lokale Stimulation des Immunsystems. Erste Daten aus Tiermodellen sind äußerst vielversprechend – aber noch unpubliziert, so Loessner.

Ebenfalls gearbeitet wird an Veränderung der Adhäsine, also jener „Beinchen“, mit denen der Phage an seine Wirtszelle andockt. Diese benötigen spezifische Strukturen auf der Oberfläche der Bakterienmembran und sind spezifisch für das jeweilige Bakterium. Der Phage kann folglich nur ein bestimmtes Bakterium infizieren. Mithilfe der Strukturbiologie und künstlicher Intelligenz (AlphaFold) ist es mittlerweile möglich, vorherzusagen, welche Strukturen eines Phagenadhäsins zur Erkennung des Bakteriums nötig sind. Auf diesem Weg ist es gelungen, Breitbandphagen herzustellen, die in der Lage sind, beispielsweise alle Serovarianten von Listerien zu infizieren.⁵

Die neueste Entwicklung in der Phagenforschung sind sogenannte Nanophagen. Das sind Phagen, an deren Adhäsine Nanobodys angekoppelt werden. Unter Nanobodys versteht man schwere Ketten von Kamel-Antikörpern. Die Camelidae unterscheiden sich von anderen Säugetieren insofern, als ihre Antikörper keine leichten Ketten aufweisen und die schweren Ketten auch einzeln funktional sind. Auf diesem Weg ist es möglich, die Adhäsine praktisch beliebig zu modifizieren. In Zukunft könnte es möglich werden, auf diesem Weg beispielsweise humane Krebszellen mit Phagen zu infizieren und damit zu töten, so Loessner. Bis dahin ist es allerdings noch ein weiter Weg. Bislang ist es gelungen, im Labor mit Nanophagen phagenresistente Stämme von E. coli zu infizieren und zu töten. Entsprechende Daten sind zur Publikation eingereicht.

Leuchtende Phagen für schnelle Labordiagnostik

Phagen können auch diagnostisch genützt werden. Sogenannte Reporterphagen enthalten Gene, die für leuchtende Enzyme, Luciferasen, codieren. In den infizierten Bakterien wird folglich Luciferase produziert, was dazu führt, dass die Bakterien zu leuchten beginnen. Mittlerweile sind unterschiedliche Luciferasen verfügbar. Loessner wies auf die Vorzüge einer Luciferase namens NanoLuc hin, die ursprünglich aus Tiefseekrill stammt und sehr hell leuchtet. Zudem handelt es sich um ein sehr kleines Molekül, hinter dem eine entsprechend kleine genetische Information steht, was den Einbau in Phagen erleichtert. NanoLuc leuchtet um rund einen Faktor 1000 heller als andere Luciferasen, was sogar die Detektion einzelner Bakterien ermöglicht.⁶ Im Rahmen des CAUTI-Phagen-Projekts wurden alle eingesetzten Phagen auch als lichtproduzierende Phagen hergestellt. Damit lässt sich auf Basis eines einfachen Labortests innerhalb von zwei Stunden aus der Urinprobe feststellen, welche Phagen in einem individuellen Fall geeignet sind, die vorliegenden Bakterien zu infizieren.⁶

Eine alternative therapeutische Option stellen die isolierten Phagenendolysine dar. Der Phage benötigt diese Hydrolasen, um nach erfolgreicher Replikation wieder aus der Wirtszelle herauszukommen, indem er die Zellmembran des Bakteriums von innen auflöst. Diese Endolysine können auch unabhängig von den kompletten Phagen eingesetzt werden, da sie hochspezifisch für das jeweilige Zielbakterium sind. Dies liegt daran, dass sie an den für das jeweilige Bakterium spezifischen Peptidbrücken zwischen den Zuckern der Bakterienmembran ansetzen. Einer der Vorteile dieser Phagenendolysine liegt darin, so Loessner, dass Bakterien keine Resistenzen gegen sie ausbilden können, da sich die Strukturen in der Zellwand des Bakteriums nicht verändern und so keine Anpassung möglich ist. Darüber hinaus ist die Wirkung vom Metabolismus des Bakteriums unabhängig. Nur in Ausnahmefällen können sich Bakterien, beispielsweise durch Kapselbildung, vor Endolysinen schützen. Gramnegative können allerdings wegen ihrer äußeren Membran aus Lipopolysacchariden von außen nicht mit Endolysinen angegriffen werden. Aufgrund ihrer hohen Spezifität sind die Phagenlysine für andere Bakterien und erwünschte Mitglieder des Mikrobioms nicht toxisch.

Einige Probleme, die dem Einsatz von Endolysinen im Weg stehen, konnten mittlerweile gelöst werden. So ist es gelungen, Biofilm durch die Kombination eines Endolysins mit einer Polysaccharid-Depolymerase erfolgreich zu attackieren.⁷ Auch intrazellulärer Staphylococcus aureus kann mit modifizierten Endolysinen in der Zelle erreicht werden.⁸ Erste Versuche mit dieser Technologie am Menschen laufen.

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Literatur: