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„Next generation sequencing“
<p class="article-intro">Die Immunisierung einer Schwangeren gegen fetale Blutgruppenmerkmale kann den Feten im Rahmen einer fetalen/neonatalen Alloimmunthrombozytopenie (FNAIT) oder einer hämolytischen Erkrankung des Feten/Neugeborenen (HDN) vital gefährden. Zur Ermittlung des Risikos in einer bestehenden Schwangerschaft ist häufig eine fetale Blutgruppenbestimmung erforderlich, die heute nicht-invasiv aus dem zellfreien Plasma der Schwangeren erfolgen kann.</p>
<p class="article-content"><div id="keypoints"> <h2>Keypoints</h2> <ul> <li>Die Risikoabklärung bei fetomaternaler Inkompatibilität erfordert die Differenzierung und Bewertung der klinischen Bedeutung des Antikörpers in einem erfahrenen Speziallabor sowie in der Regel die genetische Untersuchung beider Eltern.</li> <li>Ist der mütterliche Antikörper potenziell klinisch relevant und ist der Vater heterozygot für das implizierte Blutgruppenmerkmal, ist eine nicht­invasive fetale Blutgruppenbestimmung ab der 12. SSW indiziert.</li> <li>Ein invasives diagnostisches Vorgehen (Amniozentese, Nabelschnurpunktion) ist bei fetomaternaler Inkompatibilität heute in der Regel nicht indiziert.</li> <li>Die nicht-invasive Führung von Schwangerschaften mit fetomaternaler Inkompatibilität erfordert eine enge Abstimmung der Pränatalmedizin mit der Transfusionsmedizin/Immunhämatologie.</li> </ul> </div> <p><br /> Vor 20 Jahren berichtete die Arbeitsgruppe von Lo, dass in zellfreiem Plasma von Schwangeren fetale DNA-Fragmente nachweisbar sind.<sup>1</sup> Zellfreies Plasma enthält ca. 90 % maternale DNA-Fragmente und ca. 10 % fetale DNA-Fragmente, die aus untergehenden (apoptotischen) Zellen der Plazenta stammen. Der fetale Anteil nimmt mit dem Gestationsalter zu und erreicht zum Zeitpunkt der Geburt einen Anteil von ca. 25 % . Fetale DNA-Fragmente haben eine mittlere Länge von 143 Basenpaaren.<sup>2</sup> Die absolute Zahl der fetalen DNA-Fragmente je Milliliter Plasma ist sehr gering. Das relative Verhältnis fetaler DNA-Fragmente aus verschiedenen Chromosomen zueinander wird im Rahmen nicht-invasiver pränataler Tests (NIPT) zum Aneuploidie-Screening eingesetzt.<br />Die nicht-invasive Bestimmung des fetalen Rhesusmerkmals wurde in einigen europäischen Ländern in die Mutterschaftsvorsorge zur Indikationsstellung für die Rhesusprophylaxe bei RhD-negativen Schwangeren eingeführt.<sup>3</sup> Für andere Blutgruppenmerkmale stehen nicht-invasive Verfahren bisher nur eingeschränkt oder nicht zur Verfügung. Wir konnten zeigen, dass die klinisch relevanten fetalen thrombozytären und erythrozytären Blutgruppenmerkmale durch „next generation sequencing“ aus maternaler zellfreier Plasma-DNA bestimmt werden können.<sup>4</sup></p> <h2>Pathogenese und Genetik der fetomaternalen Inkompatibilität</h2> <p>Die Immunisierung der Schwangeren erfolgt gegen ein Blutgruppenantigen, das der Fetus von seinem Erzeuger ererbt hat. Mütterliche Antikörper der Immunglobulinklasse IgG gegen fetale Blutgruppenantigene werden aktiv über die Plazenta in den kindlichen Kreislauf transportiert und führen dort zur Destruktion fetaler Blutzellen: Es entsteht eine fetale Thrombozytopenie mit der Gefahr fetaler/neonataler Blutungen (FNAIT) oder eine fetale Anämie mit Entwicklung eines Hydrops fetalis (HDN). Die Blutgruppenantigene werden in der Regel durch eine Punktmutation („single nucleotide polymorphism“, SNP) mit konsekutivem Austausch einer Aminosäure an einem Glykoprotein der Zellmembran kodiert (eine Ausnahme stellt das Merkmal RhD dar: Der RhD-negative Phänotyp entsteht in der Regel durch Fehlen des RHD-Gens). Die betroffenen Schwangeren sind homozygot in dem betreffenden Blutgruppensystem. Der Fetus hat ein Allel von seiner Mutter sowie das antithetische Allel von seinem Vater ererbt. Er ist daher heterozygot und besitzt ein Allel, welches für das implizierte Alloantigen kodiert. Ist der Vater homozygot für das Blutgruppenalloantigen, sind 100 % der Nachkommen Merkmalsträger. Ist der Vater heterozygot, so beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass der Fetus Merkmalsträger ist, 50 % (Abb. 1). In diesem Fall ist eine Bestimmung des fetalen Genotyps erforderlich, da nur diejenigen Feten, die das paternale Merkmal ausprägen, durch die mütterlichen Antikörper gefährdet sind.</p> <p><img src="/custom/img/files/files_datafiles_data_Zeitungen_2017_Jatros_Gyn_1702_Weblinks_s16.jpg" alt="" width="1051" height="1103" /></p> <h2>Bestimmung fetaler Blutgruppen­merkmale durch „targeted next generation sequencing“</h2> <p>Unter der Annahme, dass 10 % der zirkulierenden DNA-Fragmente in mütterlichem Plasma fetalen Ursprungs sind (fraktionale fetale DNA-Konzentration), sind 5 % der Allele paternalen Ursprungs (Abb. 1). Konventionelle Methoden zum Nachweis fetaler Blutgruppenmerkmale bedienen sich in der Regel quantitativer PCR-Verfahren (z.B. TaqMan-PCR). Während der Nachweis des fetalen RHD-Gens mit diesen Methoden relativ einfach ist, gibt es beim Nachweis fetaler Blutgruppen, die durch SNPs kodiert werden, zwei Herausforderungen: Die fetale Genvariante muss vor dem Hintergrund des hohen Überschusses maternaler Genvarianten erkannt werden. Hier besteht das Risiko falsch positiver Ergebnisse. Ferner kann bei einem negativen Ergebnis nicht abgeschätzt werden, ob das negative Ergebnis infolge einer zu geringen Konzentration fetaler DNA erzielt wurde. Bei männlichen Feten können Y-chromosomale Sequenzen zum Nachweis einer ausreichenden Konzentration fetaler DNA herangezogen werden. Bei weiblichen Feten können plazentaspezifische Methylierungsmuster zum Nachweis fetaler DNA eingesetzt werden. Beide Strategien erlauben jedoch keine zuverlässige Quantifizierung fetaler DNA.<br />Wir haben ein Verfahren entwickelt, mit dem zahlreiche paternale fetale Allele parallel nachgewiesen werden können. Zunächst werden ca. 30 kurze DNA-Fragmente, die jeweils einen relevanten/informativen SNP flankieren, amplifiziert. Die Bibliothek amplifizierter DNA-Fragmente wird anschließend massiv parallel sequenziert („next generation sequencing“; Abb. 1). Dies erlaubt eine Abschätzung der fraktionalen fetalen DNA-Konzentration an Genorten, an denen die Schwangere homozygot und der Fetus Träger eines paternalen Allels ist. Liegt die fraktionale fetale DNA-Konzentration über 4 % , wird eine sichere Bestimmbarkeit paternaler Allele angenommen. Ferner fordern wir mindestens 1000 Sequenzierergebnisse („reads“) je Genort für ein valides Ergebnis. Gegenwärtig umfasst die Sequenzierstrategie folgende Genorte: RHD (RhD), RHCE (C, c, E, e), DARC [F(a), F(b)], GYPB (S, s), KEL (K, k), SLC14A1 [Jk(a), Jk(b)], ITGB3 (HPA-1a, HPA-1b), ITGA2B (HPA-3a, HPA-3b), ITGA2 (HPA-5a, HPA-5b), CD109 (HPA-15a, HPA-15b). Das Verfahren wurde in zahlreichen Fällen jeweils mit Bestätigung des Genotyps am Neugeborenen erfolgreich klinisch eingesetzt.</p> <h2>Fetale/neonatale Alloimmun­thrombozytopenie (FNAIT)</h2> <p>Für die fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie ist derzeit kein prospektives Screening in der Schwangerschaft etabliert. Die Diagnose wird daher in der Regel gestellt, wenn ein sonst unauffälliges Neugeborenes klinisch apparente Blutungszeichen (Petechien, Hämatome) entwickelt. Am häufigsten wird die FNAIT durch mütterliche Antikörper gegen das humane Plättchen-Antigen 1a (HPA-1a) hervorgerufen. In der Folgeschwangerschaft kann eine Behandlung der Schwangeren mit hoch dosiertem Immunglobulin (Behandlungsbeginn: 20. SSW; 1g/kg KG je Woche bis zur Entbindung) das Auftreten fetaler Blutungskomplikationen verhindern. Gefürchtet ist insbesondere das Auftreten intrakranieller Blutungen. Bei Feststellung der Schwangerschaft sollte u.a. eine Bestimmung des väterlichen Genotyps erfolgen. Ist der Vater heterozygot für das implizierte Antigen, besteht eine Indikation zur Feststellung des fetalen Genotyps. Wir empfehlen eine nicht­invasive Erstuntersuchung ab der 12. SSW. Häufig kann bereits in der 12. SSW eine eindeutige Diagnose gestellt werden, ggf. ist eine Wiederholung im weiteren Schwangerschaftsverlauf notwendig. Ist der Fetus Merkmalsträger, wird eine Indikation zur Immunglobulinprophylaxe gestellt. Ist der Fetus negativ für das implizierte Merkmal, sind weitere Maßnahmen in der aktuellen Schwangerschaft nicht notwendig.</p> <h2>Hämolytische Erkrankung des Feten/Neugeborenen (HDN)</h2> <p>Mütterliche Antikörper gegen fetale Blutgruppenantigene an Erythrozyten sind entweder aus vorangegangenen Schwangerschaften bekannt oder sie werden im Rahmen der Mutterschaftsvorsorgeuntersuchungen festgestellt. Auch bei der hämolytischen Erkrankung des Feten/Neugeborenen sollte zunächst festgestellt werden, ob der Vater homozygot oder heterozygot für das implizierte Merkmal ist. Ist der Vater heterozygot (z.B. RHD-heterozygot oder Kk), besteht eine Indikation zur Bestimmung des fetalen Genotyps, um festzustellen, ob in der aktuellen Schwangerschaft ein Risiko für das Auftreten einer fetalen Anämie besteht. Zur Bestimmung des fetalen RHD-Status hat sich die quantitative PCR bewährt. In der Regel ist der fetale RHD-Status ab der 12. SSW sicher zu bestimmen. Genetische Besonderheiten bei den Eltern (z.B. RHD-Kategorien; RHD-Varianten bei Personen afrikanischer Abstammung) können im Einzelfall zu falschen Phänotypvorhersagen führen. Der fetale Genotyp weiterer relevanter Blutgruppensysteme kann durch die oben beschriebene Methode ebenfalls ab der 12. SSW festgestellt werden. Aus dem Ergebnis wird die weitere Strategie zur frühzeitigen Erkennung einer fetalen Anämie durch Ultraschalldiagnostik abgeleitet.</p> <div id="Fazit"> <h2>Fazit</h2> <p>Invasive Maßnahmen zur Bestimmung fetaler Blutgruppenmerkmale bei Schwangeren mit fetomaternaler Inkompatibilität (FNAIT, HDN) können heute in der Regel vermieden werden.</p> </div> <p> </p> <p><span class="link-color"><a class="article-link" href="../fachthemen/8049" data-locked="0">zurück zum Themenschwerpunkt zur OEGGG Jahrestagung</a></span></p> <p> </p></p>
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<p><strong>1</strong> Lo YMD et al: Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997; 350: 485-7 <strong>2</strong> Chan KCA et al: Sec­ond generation noninvasive fetal genome analysis reveals de novo mutations, single-base parental inheritance, and preferred DNA ends. PNAS 2016; 113: E8159-68 <strong>3</strong> de Haas M et al: Sensitivity of fetal RHD screening for safe guidance of targeted anti-D immunoglobulin prophylaxis. Prospective cohort study of a nationwide programme in the Netherlands. BMJ (Clinical research ed.) 2016; 355: i5789 <strong>4</strong> Wienzek-Lischka S et al: Noninvasive fetal genotyping of human platelet antigen-1a using targeted massively parallel sequencing. Transfusion 2015; 55: 1538-44</p>
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