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Ist Forschung im privaten Wohnzimmer möglich?

Herstellung von 3D-Druck-Implantaten zur Rekonstruktion von Nase und Ohr

Was vor wenigen Jahrzehnten als „tissue-engineering“ mit einfachen Zell-Layern begann, hat heute eine konsequente Weiterentwicklung in Form von 3D-Druck und Bioprinting erfahren. Diese Techniken waren vor wenigen Jahren noch Science Fiction. Heute sind personalisierte Knochen-, Gelenks- und Zahnimplantate aus dem 3D-Drucker schon Standard.

Keypoints

  • Ideen müssen nicht immer in Hightech-Laboren geboren werden! Selbst hochkarätige Forschung kann, wie bei diesem Forschungsprojekt, im Wohnzimmer beginnen.

  • Der Weg von der Idee eines Medizinproduktes bis zur Anwendung am Menschen kann ein langer, steiniger Weg sein – aber wie schon ein altes chinesisches Sprichwort sagt: Er beginnt mit einem ersten Schritt.

  • Der niederschwellige und kostengünstige Zugang zu dieser Technik könnte die Anwendung später in kleinen Spitälern oder auch in Entwicklungsländern möglich machen.

  • 3D-Druck gilt als vierte industrielle Revolution und ist als „rapid prototyping“ nicht mehr aus der Industrie oder der modernen Medizin wegzudenken.

Der Weg ist bereits beschritten und jeder von uns, der Grundlagenforschung betreibt, hat das Ziel schon vor Augen … In Luc Bessons Film Das fünfte Element (1997) –mit Bruce Willis und Milla Jovovich in den Hauptrollen – wird in einer Szene gezeigt, wie aus einer abgetrennten Hand in wenigen Minuten ein komplettes Lebewesen „gedruckt“ wird. Das ist in der gezeigten Form sicher überzeichnet und unrealistisch. Aber mithilfe von technischen Apparaturen und Zellkulturen funktionstüchtige Körperteile und Organe (wieder)herzustellen wird in absehbarer Zeit Realität werden.

Es sei betont, dass es sich bei den hier dargestellten Forschungsarbeiten um die Beschreibung einer Machbarkeitsstudie („proof of concept“) handelt, die positiv und vielversprechend verlaufen ist. Die Übernahme der Ergebnisse für die Humanbehandlung ist möglich – die notwendigen Genehmigungen, Zulassungen und Verbesserung des Verfahrens vorausgesetzt.

Idee und Werkstoffsuche

In der plastischen Chirurgie stehen Operateure bei der Rekonstruktion von Nase, Ohren und deren Anteilen häufig vor besonderen Herausforderungen. Ursachen solcher (Teil-)Verluste oder Formstörungen können Traumata, Tumorerkrankungen oder Wachstumsstörungen sein. Neben der Weichteilbedeckung von Knorpelstrukturen ist auch die Wiederherstellung der Funktion solcher Strukturen von besonderer Bedeutung. Hierbei ist zu betonen, dass die Knorpelanteile in Ohr und Nase eine Formgebung erst ermöglichen und häufig je nach anatomischer Lage damit verbunden auch eine Stützfunktion wahrnehmen.

Die Grundidee des beschriebenen Forschungsprojektes war nun, die oben beschriebene wichtige Stützfunktion von einem 3D-gedruckten Implantat übernehmen zu lassen, während autologer Knorpel als Füllmaterial für die hergestellte Form dienen kann. Die Technik, Knorpel als Füllmaterial zu nutzen, ist schon seit ca. 1989 in der funktionell-ästhetischen Nasenchirurgie beschrieben und seitdem etabliert. Bei der sogenannten „Diced cartilage“-Technik wird Knorpelmaterial aus der Nasenscheidewand, dem Ohr oder der Rippe mit dem Messer zerkleinert, bis eine breiige Masse entsteht. Diese kann frei oder mit Fascia lata kombiniert werden, z.B. zur Korrektur von Unregelmäßigkeiten am Nasenrücken. Der so eingebrachte Knorpel wächst in seiner neuen Umgebung ein, verbindet sich wieder zu einem festen Verband und bleibt über die Zeit vital.

Eine weitere Überlegung bezüglich des Druckens war, einen Werkstoff zu verwenden, der am Menschen erprobt, biokompatibel und im besten Fall selbstauflösend ist. Um das komplette Verfahren des Forschungsprojektes auch für Laien verständlich zu erklären, kann man folgendes Bild aus dem Haushalt bemühen: Man erstellt mit einem 3D-Drucker eine Kuchenform, füllt diese mit Teig und stellt die Backform für die benötigte Zeit in den Ofen. Während des Backvorgangs löst sich die Kuchenform komplett auf und nach Ablauf der Backzeit kann der fertige Kuchen direkt zum Verzehr auf den Tisch gestellt werden.

Formen, Funktion und Sterilisation

Zunächst stellte sich uns die Frage, welches Druckmaterial infrage käme. Klar war von Anfang an, dass es ein thermolabiler/-stabiler Kunststoff sein musste, das heißt einer, der beim Erhitzen form- und druckbar und nach Abkühlung wieder fest und formstabil ist. Ein besonders wichtiger Punkt war die Anwendbarkeit am Menschen. Bei Verwendung neuer Materialien hätten noch Zulassungsstudien stattfinden müssen, um z.B. eine Nichttoxizität nachweisen zu können. Also lag die Überlegung nahe, auf bekannte Kunststoffe zurückzugreifen. Die genannten Voraussetzungen schränkten den Kreis der möglichen Druckmaterialien deutlich ein.

Wie bei vielen Erfindungen kam bei der Suche nach einem druckbaren Werkstoff mit den genannten Eigenschaften dann der Zufall bzw. der Spieltrieb zu Hilfe. In der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde wird eine bestimmte Kunststofffolie benutzt, um eine Nasenscheidewand zu rekonstruieren, indem auf diese Folie begradigte Knorpelteile aufgenäht werden. Die Folie (bekannt als PDS®-Folie der Firma Ethicon) besteht aus Poly-p-Dioxanon (PDO) und wird, wie das ebenfalls aus diesem Material bestehende Fadenmaterial PDS®, in der chirurgischen Praxis weltweit täglich eingesetzt.

Da zunächst kein druckbares PDO zur Verfügung stand, um zu klären, ob dieses Material thermolabil/-stabil ist, wurde diese Frage mittels einer Ohrschablone, einer PDS®-Folie und einem haushaltsüblichen Haarfön beantwortet. Wir erhitzten die Folie mit dem Fön und legten sie auf die Schablone, wo sie sich den Konturen des Ohres anpasste und dann nach dem Abkühlen erstarrte. Hiernach konnte die Folie vom Untergrund abgehoben werden und zeigte ihre neue, permanente Form (Abb. 1).

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Abb. 1: Materialtest – PDS®-Folie, Ohrmodell und Haarfön

Schon bei der Entwicklung der Idee für die Studie war eines der Ziele, den finanziellen sowie apparativen Aufwand niedrig zu halten und das Projekt so anzulegen, dass eine spätere Anwendung fernab von universitären Laboren möglich ist. Daher fiel die Wahl auch auf den handelsüblichen Consumerdrucker MK3i der Marke Prusa (Prag, Tschechien), der für unter 1000€ zu erwerben ist. Dieser Drucker arbeitet nach dem sogenannten „Fused Deposition Modeling“- (FDM) oder „Fused Filament Fabrication“(FFF)-Prinzip, bei dem ein 1,75mm dicker Filamentfaden geschmolzen und vom Drucker in übereinanderliegenden Schichten auf einer beheizbaren Druckplatte aus Metall angeordnet wird. So wächst ein Druckobjekt von unten nach oben in drei Achsrichtungen.

Um nun zu klären, welche Druck- und physikalischen Eigenschaften (Festigkeit, Biegsamkeit, Druckauflösung, Wandstärken, Kurvaturverhalten) PDO hat, wurde ein Probeobjekt am Computer entworfen und gedruckt. Mithilfe der Erkenntnisse aus diesen Kalibrierdrucken wurden dann Änderungen in der Druckdatei vorgenommen. Neben den eigentlichen Druckdaten enthält eine solche Datei auch ergänzende Angaben, unter anderem zur Verarbeitungstemperatur des Filaments, zur Geschwindigkeit des Druckes, zur Drehzahl der kühlenden Ventilatoren und zur Temperatur der Platte, auf die gedruckt wird (Abb. 2).

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Abb. 2: Kalibrationsdrucke: (A, B) eigene Konstruktion; (C) Profi-Test

Nachdem wir die richtigen Druckparameter identifizieren hatten können, erstellten und druckten wir die beiden verwendeten Implantathohlformen am Computer mittels CAD. Zunächst wurde eine Box mit perforiertem Deckel und Boden hergestellt, deren Teile formschlüssig zusammengefügt werden können, wonach der entstehende Hohlraum mit „diced cartilage“ gefüllt werden kann. Als weiteres Implantat fiel die Wahl auf eine Ohrform, da solche Gebilde aufgrund von Rinnen, Erhebungen und überhängenden Anteilen (sog. Hinterschnitten) als die Königsklasse des 3D-Druckes gelten.

Ein weiterer wichtiger Meilenstein im Projekt war neben der Erstellung der Implantate auch die Möglichkeit zur Sterilisation. Die Materialeigenschaften von PDO schließen die „üblichen“ Standardsterilisationsverfahren wie Dampf, Hitze oder Gamma-Bestrahlung aus. Sterilgut aus PDO muss daher mittels des Gases Ethylenoxid keimfrei gemacht werden. Die Validierung auf bestehende Sterilität bei den gedruckten Werkstücken erbrachte keinen Hinweis auf vitale Krankheitserreger oder ihre Vermehrungsformen sowohl im Standardabstrichtest wie auch nach zweiwöchiger Bebrütung in einer Nährbouillon.

Versuchsaufbau

Im Zeitraum von Juli 2020 bis Juli 2021 wurden die notwendigen Tierversuche durchgeführt. Die Genehmigung hierfür durch das Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft und Forschung (BMBWF) wurde unter der Geschäftszahl BMBWF 2020-0.200.447 erteilt. Mit Rücksicht auf das Tierwohl sowie der Tatsache geschuldet, dass es sich zunächst um einen „proof of concept“ handelte, wurden nur 6 Versuchstiere (weiße New-Zealand-Kaninchen) untersucht. Diese 6 Tiere wurden jeweils einer von 2 Kohorten zugewiesen.

Box mit „diced cartilage“
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Abb. 3: Boxen gefüllt mit „diced cartilage“ vor dem Zusammenklappen

Im Rahmen des ersten Tierversuchsabschnittes wurden jedem von insgesamt drei Kaninchen Ohrknorpel entnommen, zerkleinert und als „diced cartilage“ in die Hohlformen eingefüllt (Abb.3). Jedem der drei ersten Versuchstiere wurden wiederum je drei Boxen mit diced cartilage im Bereich des linksseitigen Rückens implantiert. Das erste Rekonstrukt wurde ohne Zusätze verwendet, das zweite Implantat mit humanem Fibrinkleber imprägniert und das dritte Rekonstrukt mit plättchenreichem Plasma (PRP) beträufelt, welches aus dem Vollblut desselben Kaninchens durch Zentrifugation gewonnen wurde. Die Implantate wurden nach 2, 4 und 8 Monaten entnommen und histologisch aufgearbeitet. Nach Erhalt der 2- und 4-Monats-Ergebnisse wurden dann drei weitere Tiere in einer zweiten Versuchskohorte operiert.

Ohrmuschel mit „diced cartilage“

Hierbei wurde nun ein komplizierteres Konstrukt in Form einer Ohrmuschel gewählt. Auch diese Hohlformen wurden mit „diced cartilage“ aus dem Ohrbereich der Tiere befüllt und mit einem Netz und umlaufender PDS®-Naht auf der Rückseite verschlossen, um sicherzustellen, dass der eingebrachte Knorpel sich nicht unkontrolliert im benachbarten Gewebe verteilte. (Abb. 4). Ebenso wie die Boxen, waren die Ohrrekonstrukte perforiert gedruckt, damit eine Ernährung des Knorpel- und des sich bildenden Bindegewebes sowie die Einsprossung von Gefäßen möglich war. Zusätzlich wurde PRP im oberen Ohrpol aufgebracht.

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Abb. 4: Ohrrekonstrukt gefüllt mit Knorpel: (A) von vorne und (B) von hinten mit Netz und Naht verschlossen

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Abb. 5: Fertig implantiertes Ohr mit Mini-Drain

Auf die Anwendung von Fibrinkleber verzichteten wir diesmal, da sich in den in der Zwischenzeit ausgewerteten histologischen Schnitten gezeigt hatte, dass sich das Immunsystem der Tiere gegen den Fibrinkleber humanen Ursprungs zur Wehr setzte und die Implantate vorzeitig auflöste. Dieser Umstand war zunächst unerwartet, konnte aber in einer nachträglich durchgeführten Literaturrecherche als bekanntes Phänomen aufgeklärt werden. So war die gewünschte Klebewirkung zwar gegeben (auch in anderen Versuchsansätzen), aber in unserem Versuchssetting wurde durch den Klebstoff eine subklinische und unbemerkte Immunreaktion beim Tier getriggert, die das komplette Implantat inklusive Knorpelmaterial auflöste.

Die zweite Reihe an Implantationen erfolgte ebenfalls am linksseitigen Rücken und wurde von der Einlage eines Minivac-Katheders begleitet (Abb. 5).

Ergebnisse

Bei der histologischen Aufarbeitung aller Schnittpräparate der ersten Gruppe über den gesamten Versuchszeitraum zeigte sich vitaler, neu gebildeter Knorpel in der Nachbarschaft von initial in die Implantate eingebrachtem Knorpel. Dazwischen waren aber auch kleine Zonen von avitalem Knorpel sichtbar. Die Räume zwischen den verschiedenen Knorpelzonen waren mit Bindegewebe gefüllt. Komplette Kapillaren und auch größere Gefäße inklusive Intimazellen konnten nachgewiesen werden, was für eine suffiziente Integration der verschiedenen Gewebearten und der Implantate spricht. Zusätzlich fanden sich Spuren von Knochen und blutbildendem Knochenmark. Verknöcherungen im Bereich von Knorpelstrukturen können jedoch auch beim Menschen im Rahmen von nasenchirurgischen Eingriffen histologisch nachgewiesen werden. Das operative Ergebnis beeinträchtigen diese Knochenstrukturen nicht. Zusammen mit dem Bindegewebe können sie jedoch für eine gewisse Steifigkeit des rekonstruierten Gewebes sorgen – bei vorhandener Vitalität (Abb. 6).

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Abb. 6: Histologischer Schnitt (Stern: in Auflösung befindliches PDO; Pfeile: Perichondrium; Kreis, Rechteck, Dreieck: neu ausgewachsener Knorpel; re. unten Gefäßanschnitt oberhalb des Pfeiles)

Bei den Ohrrekonstrukten kam es zu einem anderen Resorptionsverhalten. Während sich bis zu zwei Monate nach Implantation ein erwartungsgemäßes Verhalten der Implantate zeigte, nahmen die Resorptionsvorgänge bei längerem Verbleib im Körper über die Zeit deutlich zu. Ursache könnten die im Vergleich zu den eingebrachten Boxen höheren Mengen von PDO bzw. größeren Wanddicken der Ohrimplantate und damit längere Resorptionszeiten sein. Diese längeren Abbauzeiten begünstigen wiederum immunologische und zelluläre Abwehrreaktionen, die jedoch z.B. mittels Begleitmedikation wie Kortison möglicherweise für ein positiveres Outcome beeinflusst werden könnten.

Eine weitere Tatsache, die bereits aus zahlreichen wissenschaftlichen Publikationen bekannt ist, konnte in diesem Forschungsprojekt bestätigt werden: Bei Verwendung von PRP (thrombozytenreichem Plasma) ist die Vitalität des Knorpels deutlich besser als in den unbehandelten Proben oder Arealen. Diese Eigenschaft von PRP konnte in der regenerativen und kosmetischen Medizin schon bei unterschiedlichen Anwendungen bestätigt werden.

Der wichtigste Meilenstein, den die Anwendung der Implantate erreichte, besteht in der Tatsache, dass sich die Kunstoffanteile der subkutan implantierten 3D-Drucke aus PDO über einen Zeitraum von ca. 4–8 Monaten vollständig auflösten (Abb.6). Zurück bleibt ein vitales, formstabiles Gewebe, welches aus Knorpel und Bindegewebe besteht, eine gute Stützfunktion hat und sich palpatorisch im Biegetest wie „normales“ anatomisches Nasenseptum oder Ohr verhält. Im Bioprinting, bei dem z.B. Amnionzellen zum Drucken verwendet werden, zeichnen sich diese Drucke durch eine gallertartige Konsistenz aus. Im Gegensatz zu dem vorgestellten Herstellungsverfahren für Implantate fehlt diesen Drucken die konstruktive Formstabilität, die notwendig ist, damit Implantate einem gewissen Druck von außen standhalten. Dies ist etwa wichtig, wenn man auf einem so rekonstruierten Ohr nachts schlafen möchte. Implantierte Bio-Gelprints würden dabei schlicht zerdrückt werden.

Fazit aus dem „proof of concept“

Die Optimierung der Abbauprozesse und Minimierung der Immunreaktionen sind notwendig, damit die Rekonstrukte über die Zeit formpermant bleiben und das Ergebnis der operativen Maßnahmen nicht durch unkontrollierte Resorptionsvorgänge kompromittiert wird. Dies sind vorrangige Ziele unserer weiteren Forschungsarbeit. Dazu müssen u.a. Modifikationen der Rekonstrukte erfolgen, wie etwa die Verminderung der notwendigen Implantatwandstärken und damit der Gesamtmenge des verdruckten Kunststoffes. Eine weitere Verbesserung könnte die Verwendung von Rippenknorpel in den Implantaten sein, da dies der Goldstandard bei der Ohrrekonstruktion ist. Auch begleitende pharmakologische Adjuvantien sind gegebenenfalls erforderlich bzw. hilfreich.

Neben den hier beschriebenen Einsatzgebieten wären auch Anwendungen in der Gelenks- oder auch Knochenchirurgie möglich. Eine Limitation des Verfahrens ist die Verwendung bei Kindern, da die systematische Anordnung von Knorpelkernen, wie diese im Rahmen der Kindes- und Embryonalentwicklung gegeben ist, beim 3D-Rekonstrukt fehlt – es könnte also nicht mitwachsen. Eine mögliche Weiterentwicklung der vorgestellten Technik wäre die Kombination mit Zellkulturen. Dies jedoch wäre nur unter Bedingungen eines Hightech-Labor zu realisieren.

Um die im Titel formulierte Frage zu beantworten: Ja, die Grundsteinlegung für verschiedene Forschungsprojekte ist tatsächlich noch heute im Wohnzimmer möglich. Um den Vergleich zu bemühen: Die Gründungen so mancher Weltfirmen haben in privaten Garagen stattgefunden. Man erinnere sich an die ersten Jahre von Microsoft oder Apple …

Das hier dargestellte Forschungsprojekt stellt eine auszugsweise Veröffentlichung aus Teilen der Habilitationsarbeit von Dr. Hellekes dar. Bildmaterial, Textpassagen und Ergebnisse entstammen aus o.g. Arbeit und gelten damit als aus dieser Originalquelle zitiert.

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