Dreidimensionale In-vitro-Modelle für humane Haut

Die Haut dient als wichtige Barriere, die den Körper vor physikalischen, chemischen und pathogenen Gefahren schützt und den bidirektionalen Transport von Wasser, Ionen und Nährstoffen reguliert. Um mehr Wissen über die Struktur und Funktion der Haut sowie über Hautkrankheiten zu generieren, werden häufig Tierversuche durchgeführt. In-vitro-Modelle, wie z.B. rekonstruierte humane Epidermis- oder Vollhautäquivalente, sind wertvolle Alternativen zu Tierversuchen. In der Vergangenheit wurden enorme Fortschritte bei der Herstellung von unterschiedlichen Hautmodellen mit zunehmender Komplexität erzielt. Zu den neuesten Errungenschaften zählen unter anderem der Einsatz von induzierbaren pluripotenten Zellen sowie neuartige 3D-Bioprinting-Verfahren.

Die Haut steht an der vordersten Front unseres Körpers und fungiert als Hülle, die den Organismus vor schädlichen Umwelteinflüssen wie Chemikalien, UV-Strahlung oder Krankheitserregern schützt. Tierversuche wurden und werden häufig verwendet, um die grundlegende Struktur der Haut, die Mechanismen der Wundheilung sowie unterschiedliche Hautkrankheiten zu erforschen. Die anatomischen Unterschiede zwischen Tier und Mensch beeinträchtigen jedoch häufig die Übertragbarkeit von Tierversuchen.^1–3 Die Modellierung der menschlichen Haut in vitro würde die Übertragbarkeit der Ergebnisse gewährleisten und Tierversuche bei der präklinischen Bewertung neuartiger Therapieansätze reduzieren. Das „3R“-Prinzip (Replacement, Reduction und Refinement) der humanen Tierforschung ist weltweit anerkannt und in vielen nationalen und internationalen Gesetzen verankert.² Ein voll funktionsfähiges, vollständig humanes In-vitro-Modell sollte eine native Hautstruktur und -funktionalität aufweisen; es sollte unterschiedliche Zelltypen enthalten, die sich sowohl vermehren als auch differenzieren können und zugleich auch Fettgewebe und Blutgefäße beinhalten. Ein solches ideales Modell würde sowohl die Infiltration von Immunzellen als auch eine langfristige Kultivierung ermöglichen. Es gibt bereits einige Modelle, die diesem Ziel nahekommen, jedoch sind noch weitere Optimierungen vonnöten.

Rekonstruierte humane Epidermis (RHE) und humanes Hautäquivalent (HSE)

Für die rekonstruierte menschliche Epidermis (RHE) beispielsweise werden normale menschliche Keratinozyten aus Hautbiopsien isoliert und in einem Kulturmedium expandiert. Die Zellen werden kurzzeitig unter submersen Bedingungen bzw. im Nährmedium kultiviert, bevor sie an die Luft-Flüssigkeits-Grenze gebracht (sogenannter „Air-lift“) werden, was essenziell für die Differenzierung der Keratinozyten ist.^4,5 In einem kontinuierlichen Prozess, der etwa zwei Wochen dauert, bildet sich eine epidermisähnliche Struktur, die nachweislich die morphologischen, biochemischen und physiologischen Eigenschaften der nativen Epidermis zuverlässig reproduziert.^6–8 Neben der rekonstruierten Epidermis wurden humane Hautäquivalente (HSE), sogenannte Vollhautmodelle, entwickelt. Diese bestehen aus einer dermalen Schicht, welche aus einer mit dermalen Fibroblasten besiedelten 3D-Matrix aufgebaut ist. Hierbei werden Keratinozyten nach ausreichender Kultivierung auf dieses Grundgerüst aufgebracht und integriert. Ähnlich wie bei der Herstellung von RHE werden die HSE für kurze Zeit unter submersen Kulturbedingungen inkubiert, bevor der „Air-lift“ durchgeführt und die Keratinozytendifferenzierung eingeleitet wird.⁹

Weiterentwicklung der Modelle mit zunehmender Komplexität

Künftige HSE würden von einem dreischichtigen Aufbau mit einer hypodermalen Schicht profitieren, der der physiologischen Hautanatomie entspricht und wichtige Funktionen wie die Hormonsekretion vermittelt.^10–12 Die Einführung von Immunkompetenz in HSE ist ebenso ein wichtiges Thema im Tissue-Engineering, da das Fehlen von Immunzellen die physiologische Relevanz der derzeitigen HSE einschränkt. Insbesondere die Entzündung, ein wesentlicher Faktor bei der Wundheilung, hängt sowohl von gewebeeigenen Immunzellen als auch von Immunzellen ab, die aus dem Blutkreislauf rekrutiert werden.¹³ Eine wichtige Herausforderung besteht darin, alle notwendigen Signale für die verschiedenen Immunzellpopulationen bereitzustellen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit und Funktionalität von Keratinozyten, Fibroblasten und möglicherweise Adipozyten zu erhalten. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass die Zusammensetzung des Kulturmediums ein kritischer Faktor bei der Einbringung von Makrophagen in ein HSE ist.¹⁴

Die Durchblutung des Konstrukts ist ebenfalls eine weitere große Herausforderung auf dem Weg zu einem physiologischeren In-vitro-Hautmodell. Die Vaskularisierung des dermalen (und hypodermalen) Kompartiments wäre für die Erforschung der Entwicklung von Hautkrankheiten, der Wundheilung, der Metastasierung von malignen Melanomen oder auch der Pharmakodynamik von wesentlicher Bedeutung. Ein HSE, das ein Gefäßsystem auf der Grundlage einer Matrix, bei der zuvor alle Zellen entfernt wurden (sog. dezellularisiert) und konservierte Gefäßstrukturen enthält, ist ein vielversprechender Ansatz.¹⁵ Auch die Fortschritte beim 3D-Biodruck zeigen vielversprechende Ergebnisse,¹⁶ obwohl die Mikrozirkulation der Haut noch nicht vollständig nachgeahmt werden kann.

Ein weiterer wichtiger Bestandteil der Haut sind Nerven. Um innervierte Hautäquivalente zu erzeugen, wurden bereits Neuronen der Dorsalwurzelganglien entweder von Schweinen¹⁷ oder von Mäusen¹⁸ in ansonsten vollständig menschliche Hautäquivalente integriert. Ein weiterer Ansatz ist die Verwendung von induzierten humanen neuralen Stammzellen (ihNSCs), welche durch direkte Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten erzeugt werden können.¹⁹ Diese ihNSCs differenzieren sich unabhängig von der Medienzusammensetzung in Neuronen, sind robust und behalten ihren neuronalen Phänotyp auch in komplexen Ko-Kulturen bei. Mithilfe des ihNSC-Ansatzes konnte bereits ein vollständig humanes innerviertes HSE erfolgreich hergestellt werden, was wiederum die In-vivo-Situation widerspiegelt.²⁰

3D-Bioprinting

Eine revolutionäre Technologie in diesem Forschungsgebiet ist das sogenannte 3D-Bioprinting. Bei dieser Methode werden zur Herstellung dreidimensionaler komplexer biologischer Strukturen lebende Zellen, Biomaterialien („Bio-Tinten“) und biologische Moleküle als Ausgangsmaterial für den schichtweisen Druck verwendet. Bei diesem additiven Herstellungsverfahren können Gewebekonstrukte mit einem individuellen Design auf hochflexible und reproduzierbare Weise erzeugt werden.^21,22 Die Möglichkeit, anatomisch präzise Strukturen mit verschiedenen Zelltypen herzustellen, ist ein Highlight des 3D-Bioprintings, insbesondere im Hinblick auf die Option, gefäßähnliche Strukturen in diese Konstruktion einzubeziehen.^16,23,24

Fazit

Komplexe HSE sind wertvolle und vielversprechende Instrumente für die Erforschung der Struktur und Funktion der Haut. Innovative Technologien wie die Verwendung von iPSCs und 3D-Bioprinting sind natürlich anspruchsvoll, werden aber die Entwicklung menschlicher Hautmodelle nachhaltig beeinflussen. Neben der Grundlagenforschung können zukünftig noch komplexere Hautmodelle auch für die Erforschung von Hautkrankheiten und die kutane Wundheilung mit hoher translationaler Effizienz eingesetzt werden. Die standardisierte Erstellung von humanen Vollhaut-Äquivalenten wird es ermöglichen, diese in Experimenten zum Wirkstoffscreening einzusetzen und damit Tierversuche zu ersetzen oder zumindest stark zu reduzieren.

Literatur: